小腸缺血再灌注損傷機(jī)制的研究進(jìn)展和防治策略

叢若塵，何伯圣

(南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院影像科，江蘇 南通 226001)

缺血再灌注損傷是臨床上許多嚴(yán)重疾病的共同病理生理過程[1-2]。小腸血供主要依賴腸系膜上動脈，由于小腸絨毛末端為微小動靜脈的直接交通，所以容易導(dǎo)致缺血再灌注損傷[2-4]。小腸缺血再灌注損傷的誘發(fā)病因很多，如小腸整體或局部血流灌注的急速降低(腸系膜動脈栓塞、靜脈血栓、腸梗阻、機(jī)械性絞窄、休克或藥物等原因)、心血管手術(shù)、腸道移植等。缺血再灌注損傷可導(dǎo)致小腸組織自微血管至腸系膜血管的整套血液循環(huán)發(fā)生改變，嚴(yán)重時可引發(fā)遠(yuǎn)隔臟器受損、全身性炎癥反應(yīng)、多器官功能衰竭甚至導(dǎo)致死亡[5-6]。隨著我國逐漸步入老齡化社會，以及心臟病、高血壓和高血脂等疾病高發(fā)，腸缺血的發(fā)病率和病死率逐年上升。然而，在臨床上腸缺血患者初期癥狀較重而體征較輕，容易造成漏診或誤診，臨床醫(yī)師根據(jù)患者癥狀、體征或影像學(xué)確診時，多數(shù)已為晚期。故尋找腸缺血保護(hù)性治療的干預(yù)靶標(biāo)迫在眉睫。但目前，臨床上尚無針對缺血再灌注損傷的特效藥物和療法，原因主要是缺血再灌注損傷機(jī)制尚不明確。根據(jù)最近提出的引發(fā)小腸細(xì)胞壞死、凋亡的一系列假說和理論，研究者們相繼提出了一些缺血再灌注損傷預(yù)防和治療方案。但這些防治措施大多還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段且實(shí)際效果并不理想，無法直接應(yīng)用于臨床實(shí)踐?，F(xiàn)就小腸缺血再灌注損傷機(jī)制的研究進(jìn)展和防治策略予以綜述。

1 小腸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和缺血再灌注損傷模型

小腸結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，主要由黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜構(gòu)成，其中黏膜上皮層在小腸消化吸收、分化增殖等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。另外，小腸的血供豐富，是機(jī)體最大的儲血器官，其血流量與局部組織的活動水平密切相關(guān)，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時，血流會在短時間內(nèi)從胃腸道快速轉(zhuǎn)移至心腦、骨骼肌等重要臟器，因此會導(dǎo)致消化道黏膜發(fā)生缺血壞死[7-8]。小腸黏膜缺血會破壞上皮層細(xì)胞的功能，使上皮細(xì)胞喪失再生能力，削弱黏膜的屏障作用，進(jìn)而引起細(xì)菌移位、內(nèi)毒素釋放[9]。另外，應(yīng)激反應(yīng)的激活可使機(jī)體釋放大量的炎癥因子和過氧化物，進(jìn)一步增加黏膜通透性，從而導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)和多臟器功能不全[10]。

從目前的研究來看，有多種動物模型(如豬、犬、貓、鼠)可用于小腸缺血再灌注損傷的研究，且每種動物模型均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)(表1)[11]。在所有動物模型中，豬與人的血管結(jié)構(gòu)最接近，其小腸絨毛微小靜脈分布于微小動脈兩側(cè)；而鼠與人的血管結(jié)構(gòu)不完全相同，其腸絨毛微小動脈到達(dá)頂端后分成兩支微小動脈，隨后形成動脈網(wǎng)，最后匯入引流靜脈[12]。

目前的研究中最常用的損傷模型為鼠，缺血處理方式包括夾閉或結(jié)扎腸系膜上動脈[13]。夾閉或結(jié)扎腸系膜上動脈需要行開腹手術(shù)，容易造成全身性炎癥反應(yīng)，動物病死率較高。有研究表明，采用介入的方法，經(jīng)導(dǎo)管將吸收性明膠海綿顆粒注入豬的腸系膜上動脈能獲得良好的小腸缺血再灌注損傷模型，且模型動物術(shù)后存活率高，可排除炎癥對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，能更好地模擬人類的小腸缺血再灌注損傷[14-15]。可見，缺血再灌注模型構(gòu)建成功與否不僅與動物選擇有關(guān)，還與腸缺血模型的處理方式密切相關(guān)。另外，缺血時間和部位也需要考慮，缺血時間過短，可能組織損傷不明顯，而時間過長則組織壞死嚴(yán)重，會掩蓋后續(xù)的灌注損傷。同時，小腸不同部位對缺血的敏感程度也有差異，十二指腸、空腸、回腸的耐受性依次逐漸提高[16]。因此，需要根據(jù)研究內(nèi)容和研究目的選擇合適的模型、缺血時間以及取材部位。

表1 常用于小腸缺血再灌注研究的動物模型及優(yōu)缺點(diǎn)

2 小腸缺血再灌注損傷的分子生物學(xué)機(jī)制

小腸缺血再灌注損傷可能是多種因素共同作用的結(jié)果。目前缺血再灌注損傷的內(nèi)在機(jī)制尚不清楚。但研究者們已在DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和細(xì)胞水平取得了很多突破，并提出了一系列新的學(xué)說。這些研究成果不但對缺血再灌注損傷機(jī)制的完善具有重要意義，也為后續(xù)防治技術(shù)的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

2.1線粒體損傷 線粒體是為機(jī)體提供能量和維持鈣穩(wěn)態(tài)的主要細(xì)胞器，也是機(jī)體應(yīng)對應(yīng)激反應(yīng)的第一道門戶。缺血再灌注損傷可引起呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ和呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅱ的活性下降，并產(chǎn)生大量的活性氧自由基，阻礙ATP合成[17]。氧自由基能改變線粒體的通透性，引起細(xì)胞色素C等損傷因子釋放，加重細(xì)胞毒性[18]。機(jī)體內(nèi)ATP合成、Ca2+吸收、自由基的產(chǎn)生過程均與線粒體膜電位的變化密切相關(guān)[19]。另有研究證實(shí)，線粒體膜電位變化在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與壞死中發(fā)揮重要作用，線粒體滲透轉(zhuǎn)化孔開放會造成內(nèi)膜兩側(cè)氫離子濃度梯度消失，導(dǎo)致膜電位下降、線粒體腫脹破裂，線粒體釋放大量促凋亡因子，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡、壞死[20]。

此外，線粒體膜上存在的兩種ATP酶，即Na+，K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶，它們是維持線粒體正常結(jié)構(gòu)和功能所必需的離子泵，直接影響線粒體的各項(xiàng)重要功能。鈉泵失活后，將引發(fā)線粒體膜內(nèi)外離子的重新排布，尤其是引發(fā)Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，激活線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔，而活化的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔又促使線粒體發(fā)生功能性和結(jié)構(gòu)性崩解，從而引發(fā)細(xì)胞死亡[20-21]。同樣，Ca2+-ATP酶活性增強(qiáng)后，也會引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，細(xì)胞發(fā)生能量代謝障礙，最終也會引發(fā)細(xì)胞死亡[22]。另有研究證實(shí)，發(fā)生缺血再灌注損傷后，小腸線粒體上的兩種ATP酶活性將發(fā)生變化，Na+，K+-ATP酶活性受到抑制，Ca2+-ATP酶異常升高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，最終影響細(xì)胞活性[23]。

2.2活性氧自由基致病機(jī)制 研究表明，活性氧自由基與消化道疾病關(guān)系密切，特別是在小腸缺血再灌注損傷中，氧自由基危害極大，它主要以兩種形式存在，即自由基與非自由基，自由基主要是指超氧陰離子自由基，非自由基主要指過氧化氫、單線態(tài)氧等[24]。正常情況下，機(jī)體存在一定的抗氧化防御系統(tǒng)，能夠清除體內(nèi)過多的氧自由基，從而避免組織細(xì)胞發(fā)生損傷。當(dāng)小腸發(fā)生缺血再灌注損傷時，血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生黃嘌呤和次黃嘌呤，兩者在黃嘌呤氧化酶的催化作用下產(chǎn)生大量的氧自由基，而氧自由基能夠攻擊DNA，引起蛋白質(zhì)、酶變性失活，具體機(jī)制包括：腸黏膜中脂質(zhì)過度氧化后，細(xì)胞膜的脂肪酸與蛋白質(zhì)比例失調(diào)，導(dǎo)致通透性增加，促使大量有害物質(zhì)進(jìn)入微循環(huán)，造成組織器官損害；同時，丙二醛等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物蓄積到一定程度會破壞細(xì)胞正常的生理功能，引起蛋白質(zhì)、酶變性以及維生素失活等[25]。攻擊氨基酸殘基，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使其失活[26]；脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可通過與蛋白、酶發(fā)生作用，調(diào)節(jié)其活性，影響受體及膜離子通道，造成物質(zhì)運(yùn)輸、信息傳遞和免疫應(yīng)答過程受阻[27]。直接或間接作用于DNA，引發(fā)堿基修飾或單雙鏈斷裂，不同進(jìn)攻部位有不同的產(chǎn)物，羥自由基很容易將腺嘌呤或鳥嘌呤的C-8位轉(zhuǎn)變?yōu)锳-8OH或G-8OH，導(dǎo)致嘌呤發(fā)生開環(huán)反應(yīng)(無法通過DNA修復(fù)系統(tǒng)糾正)[28]。氧自由基能攻擊信使RNA，降低ATP酶的活性，使能量供應(yīng)不足、離子泵的活性降低，造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載，當(dāng)線粒體攝取的Ca2+超過自身承受范圍時，便會引發(fā)自身腫脹破裂[29]。

2.3活性氮自由基致病機(jī)制 活性氮自由基是自由基家族的另一個重要成員，盡管其僅占自由基家族的5%左右[28]，但仍然在小腸缺血再灌注損傷中發(fā)揮著舉足輕重的作用。氮自由基主要由一氧化氮和二氧化氮構(gòu)成，而一氧化氮為近年來的研究熱點(diǎn)之一。一氧化氮生物學(xué)活性極強(qiáng)，一方面可作為第二信使，參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程；另一方面還可作為一種高效應(yīng)分子參與殺滅病原微生物和腫瘤細(xì)胞的過程，從而發(fā)揮細(xì)胞毒作用[30]。機(jī)體在正常情況下，胃腸消化道內(nèi)含有一定量的一氧化氮，對消化道黏膜起到一定的保護(hù)作用，但當(dāng)機(jī)體發(fā)生小腸缺血再灌注損傷時，體內(nèi)一氧化氮合酶催化形成更多的一氧化氮，而過量的一氧化氮會誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性物質(zhì)，如一氧化氮可促進(jìn)鐵蛋白吸收腸道中的鐵，使其被釋放入血，從而間接抑制線粒體供能和DNA合成；此外，還能間接誘導(dǎo)鈣通道的開放，引發(fā)鈣超載，觸發(fā)體內(nèi)還原型輔酶Ⅱ氧化酶活化，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基，對腸黏膜產(chǎn)生破壞作用[31]?？傊谎趸獙δc黏膜的破壞作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其保護(hù)作用。Gordeeva等[32]發(fā)現(xiàn)，大鼠腸黏膜內(nèi)一氧化氮代謝產(chǎn)物的濃度在再灌注早期緩慢增長，至再灌注晚期濃度驟然提高，在相對應(yīng)時間段依次進(jìn)行腸黏膜組織取樣，Chiu病理評分結(jié)果顯示，腸黏膜損傷程度隨著再灌注時間的延長，黏膜損傷程度逐步加重，至再灌注晚期達(dá)到頂峰，由此證明了一氧化氮對腸黏膜的作用是以損傷為主。

2.4細(xì)胞內(nèi)鈣超載 鈣超載是指各種原因引起的細(xì)胞內(nèi)鈣含量異常增多、鈣平衡系統(tǒng)功能失調(diào)，并導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能代謝障礙的現(xiàn)象。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)與鈣通道開放和關(guān)閉有關(guān)，同時受鈣泵和鈉-鈣交換蛋白的調(diào)控。當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺血缺氧時，體內(nèi)ATP生成不足，鈉-鉀交換蛋白活性降低，使得細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+增加，K+濃度降低，這種膜內(nèi)外離子分布異常會打破細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，最終加重細(xì)胞的損傷[33]。鈣超載主要通過下列幾種方式加重缺血再灌注損傷對細(xì)胞的傷害：當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度異常增多時，可促使線粒體攝取Ca2+增加，而Ca2+濃度增加將阻礙線粒體氧化磷酸化的過程，影響ATP的合成；Ca2+增加將激活鈣依賴性降解酶-磷脂酶A和磷脂酶C的活性，引起膜磷脂水解，并釋放大量血管活性物質(zhì)(如花生四烯酸)，在環(huán)加氧酶及脂加氧酶的作用下，花生四烯酸又生成前列腺素、白三烯等血管活性物質(zhì)，使血管進(jìn)一步收縮，加劇缺血后低灌注損傷；Ca2+進(jìn)入線粒體后，使細(xì)胞色素氧化酶功能失調(diào)，氧經(jīng)單電子還原形成氧自由基，致氧自由基產(chǎn)生過多，同時過氧化氫酶活性降低，氧自由基清除減少，會進(jìn)一步加重組織器官缺血損傷[34]。

2.5炎癥反應(yīng) 炎癥反應(yīng)是炎癥細(xì)胞與其所產(chǎn)生的各類炎癥介質(zhì)相互作用的結(jié)果。巨噬細(xì)胞是細(xì)胞外活性氧類的主要來源，也是引發(fā)再灌注損傷的主要炎癥細(xì)胞，當(dāng)小腸發(fā)生缺血再灌注損傷時，體內(nèi)巨噬細(xì)胞被大量激活，可引起內(nèi)皮損傷和炎癥細(xì)胞因子釋放[35-36]。缺血再灌注可導(dǎo)致腸黏膜損傷并促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，從而導(dǎo)致全身反應(yīng)，具體機(jī)制包括血管內(nèi)皮張力喪失、白細(xì)胞和血小板與血管壁的黏附、細(xì)胞膜損傷，尤其是線粒體膜受損[37]。腸道的缺血再灌注損傷引發(fā)細(xì)菌移位和內(nèi)毒素釋放，導(dǎo)致細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)和促炎介質(zhì)釋放，最終將造成全身性炎癥反應(yīng)和多個器官功能障礙[38]。

2.6細(xì)胞凋亡 在缺血早期，為適應(yīng)低糖低氧環(huán)境，機(jī)體會啟動自身保護(hù)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡水解，以保障重要生命活動正常進(jìn)行；然而，當(dāng)缺血時間延長時，鈣超載、氧自由基和溶酶體酶等導(dǎo)致細(xì)胞壞死，并釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，最終使病變部位擴(kuò)大[39]。缺血早期，在缺血部位周圍的細(xì)胞會自主啟動凋亡程序，而不伴隨炎癥反應(yīng)，控制病變區(qū)向外擴(kuò)張[40]，起到保護(hù)作用。另一方面，缺血導(dǎo)致的凋亡也有其不利的一面，由于線粒體被破壞，凋亡細(xì)胞會產(chǎn)生活性氧，并激活蛋白水解酶胱天蛋白酶，引起細(xì)胞丟失和功能障礙[41]；如果缺血持續(xù)，細(xì)胞膜崩解，細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì)引起周圍細(xì)胞死亡，導(dǎo)致病變部分?jǐn)U大[39]。

3 小腸缺血再灌注損傷的預(yù)防及治療措施

3.1預(yù)防措施 針對小腸缺血再灌注損傷可能的發(fā)生機(jī)制，目前主要存在兩種預(yù)防措施，即缺血預(yù)處理和缺血后處理。缺血預(yù)處理是組織對短暫缺血期的適應(yīng)性反應(yīng)，以預(yù)先調(diào)節(jié)并保護(hù)組織免受隨后的長期缺血性損傷和再灌注損傷[42]。具體措施為：組織器官缺血前，提前進(jìn)行一次或多次短暫的、重復(fù)的缺血及再灌注。缺血預(yù)處理是一種簡單的操作，可以保護(hù)關(guān)鍵器官，并具有臨床應(yīng)用價值，但缺血預(yù)處理緩解腸道損傷的機(jī)制仍有待闡明[43]。

缺血后處理是指在可控的再灌注過程中，以再灌注和缺血一系列重復(fù)循環(huán)的形式進(jìn)行的、增加器官對缺血再灌注損傷抵抗力的一種措施。缺血后處理具有特定時間，應(yīng)在缺血后的初始再灌注期間立即應(yīng)用。大量的臨床前研究表明，缺血后處理是一種安全且具有臨床適用性的方法，能減輕缺血再灌注損傷對小腸等組織器官的傷害[44-45]。但由于缺乏臨床標(biāo)準(zhǔn)，該方法尚不能在臨床治療中應(yīng)用和普及。

3.2治療措施

3.2.1能量療法 當(dāng)小腸發(fā)生缺血再灌注損傷時，細(xì)胞內(nèi)ATP合成不足會引發(fā)一系列能量代謝障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Hao等[46]證實(shí)，ATP含量不足或線粒體功能障礙將阻斷細(xì)胞內(nèi)一系列不可缺少的ATP依賴性過程，包括神經(jīng)元膜上的離子平衡。Mueller等[47]通過腸腔注射方式給予SD大鼠肌酸補(bǔ)充液，能夠?yàn)槿毖哪c道補(bǔ)充一定量的ATP，從而減輕缺血再灌注后腸黏膜上皮的損傷，維持腸黏膜屏障的完整性。Hansen等[48]通過C57BL/6小鼠小腸缺血再灌注損傷模型證實(shí)，應(yīng)用去乙酰化酶沉默調(diào)節(jié)蛋白1可以提高缺血組織的線粒體水平，從而降低缺血再灌注造成的腸黏膜損傷水平。目前，能量療法的保護(hù)作用已在基礎(chǔ)研究中得到證實(shí)，但仍需進(jìn)一步臨床研究的驗(yàn)證。

3.2.2抗自由基療法 抗自由基是治療小腸缺血再灌注損傷的重要手段。目前，已發(fā)現(xiàn)存在多種抗氧自由基的物質(zhì)，包括ATP、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、白藜蘆醇、褪黑素等[49-51]。Chang等[52]利用SD大鼠小腸缺血模型證實(shí)，褪黑素聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能夠抵抗氧自由基損傷腸道黏膜上皮，減輕缺血再灌注損傷。Han等[53]證明，脂氧素A4能夠減輕實(shí)驗(yàn)組大鼠的小腸黏膜損傷。然而，許多在基礎(chǔ)研究中已證實(shí)對缺血再灌注損傷有作用的藥物，在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)不佳甚至完全沒有效果，部分原因可能歸結(jié)于個體間藥物反應(yīng)存在較大差異。

3.2.3抗白細(xì)胞黏附療法 小腸發(fā)生缺血再灌注損傷時，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，將啟動一系列促炎癥反應(yīng)，白細(xì)胞被激活，黏附于各級血管內(nèi)壁(尤其是微小血管)，造成微循環(huán)障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致組織器官損傷[32]。Gordeeva等[32]利用Wistar大鼠模型證明，在缺血再灌注損傷后，隨著再灌注時間的延長，內(nèi)皮依賴性小動脈的擴(kuò)張、毛細(xì)血管中白細(xì)胞的積聚以及毛細(xì)血管后微靜脈中白細(xì)胞和血漿蛋白的外滲均會導(dǎo)致微循環(huán)障礙逐漸加重。通過壓制白細(xì)胞激活、阻礙白細(xì)胞黏附分子合成、減少白細(xì)胞內(nèi)皮黏附等措施，可降低小腸缺血再灌注損傷程度。

3.2.4抗腸上皮細(xì)胞凋亡法 細(xì)胞凋亡是小腸缺血再灌注損傷的最終結(jié)局。隨著再灌注時間的延長，腸黏膜上皮細(xì)胞損傷越來越重，凋亡細(xì)胞也越多，理論上，通過下調(diào)或上調(diào)體內(nèi)凋亡基因或抑凋亡基因的表達(dá)水平，能夠減少因缺血再灌注損傷而造成的腸上皮細(xì)胞凋亡[54]。已有研究表明，上調(diào)微RNA-146a表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組大鼠體內(nèi)的細(xì)胞凋亡標(biāo)志物胱天蛋白酶3水平較對照組顯著降低[55]。Kim等[56]通過SD大鼠模型證實(shí)，缺血90 min再灌注120 min后，實(shí)驗(yàn)組大鼠口腔和頰黏膜血清腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6水平顯著高于對照組。目前，抗上皮凋亡類藥物仍處于研發(fā)階段，尚無關(guān)于此類藥物的研究報(bào)道。

4 小 結(jié)

小腸缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜、多因素的病理生理過程。隨著腸缺血發(fā)病率的逐年增高，小腸缺血再灌注損傷在臨床中也越來越受到人們的關(guān)注。為攻克該臨床難題，廣大科研工作者們對小腸缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制展開多次深入研究。但目前小腸缺血再灌注損傷治療和處理的研究大多處于基礎(chǔ)研究階段，針對小腸缺血再灌注損傷主要以預(yù)防和對癥處理為主，仍缺乏理想的治療方法。缺血再灌注損傷機(jī)制研究的滯后已經(jīng)嚴(yán)重影響了小腸移植、腸缺血后血運(yùn)重建手術(shù)等治療的開展，并給腸缺血患者帶來極大的風(fēng)險(xiǎn)。因此，亟待小腸缺血再灌注損傷機(jī)制研究能獲得突破，以推動小腸缺血性疾病的治療和移植技術(shù)的快速進(jìn)展。