PD-1及其配體在器官缺血再灌注損傷中的作用

李春喜，吳友平，屠偉峰

(1.武裝警察部隊北京市總隊醫(yī)院麻醉科，北京100027； 2.駐香港部隊醫(yī)院手術(shù)室，香港 999077；3.解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院麻醉科，廣州 510010)

缺血再灌注損傷是指組織器官缺血后再灌注并不能使組織器官功能恢復，反而加重組織器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。缺血再灌注損傷常發(fā)生于嚴重創(chuàng)傷、失血性休克、心搏驟停復蘇及器官移植手術(shù)后。關(guān)于缺血再灌注損傷的作用機制尚未完全闡明，目前認為氧自由基的作用、細胞內(nèi)鈣超載、白細胞激活和細胞凋亡等均是導致缺血再灌注損傷的重要病因[1]，但是否還存在其他機制尚不清楚。由于發(fā)病機制復雜，目前對缺血再灌注損傷尚無有效的治療手段。免疫反應(yīng)介導的機制在缺血再灌注損傷中的作用越來越受到重視。T細胞參與的特異性免疫反應(yīng)可能在再灌注后晚期發(fā)揮作用[2]。共刺激分子程序性細胞死亡受體1(programmed cell death protein 1，PD-1)及其配體PD-L(programmed cell death-ligand)1、PD-L2廣泛分布于各種免疫細胞，是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)分子[3]。PD-1與其配體結(jié)合不僅參與外周組織的免疫耐受，而且在腫瘤免疫、器官移植及多種感染性疾病中有巨大作用[4]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，PD-1及其配體在器官缺血再灌注損傷中也具有非常關(guān)鍵的作用[5]?，F(xiàn)就近年來國內(nèi)外關(guān)于PD-1及其配體在腸、腦、腎臟、心臟和肝臟等不同器官缺血再灌注損傷中的作用及機制予以綜述。

1 PD-1及其配體的表達與功能

PD-1是B7-CD28家族的一員，包含一個免疫受體酪氨酸的抑制基序和一個免疫受體酪氨酸開關(guān)基序，是由CD4+和CD8+T細胞、自然殺傷T細胞、B細胞、單核細胞及一些樹突狀細胞亞群等多種活化的免疫細胞共同表達的一種抑制性受體[3]。PD-L1和PD-L2是PD-1的兩個已知配體，它們具有不同的表達模式。PD-L1在小鼠淋巴樣細胞(如T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、間充質(zhì)干細胞和骨髓源性肥大細胞)上有組成性表達，在非造血細胞中也有表達；PD-L2的表達僅限于巨噬細胞、樹突狀細胞、骨髓源性肥大細胞和腹膜B1細胞[3]。

PD-1與其配體結(jié)合后引起胞質(zhì)區(qū)酪氨酸殘基磷酸化，在T細胞的激活過程中傳遞負性共刺激信號，進而抑制淋巴細胞增殖和細胞因子產(chǎn)生，促進淋巴細胞凋亡；另外，PD-1及其配體廣泛參與外周組織的免疫耐受，以PD-1及其配體為靶點的免疫調(diào)節(jié)治療對抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及移植器官存活等均具有重要意義[6]。

2 器官缺血再灌注損傷的機制

缺血再灌注損傷是指組織器官缺血后再灌注并不能使組織器官功能恢復，反而加重組織器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。缺血再灌注損傷的發(fā)病機制復雜，包括氧自由基的作用、細胞內(nèi)鈣超載及白細胞的作用和細胞凋亡等[1]，但任一機制均不能完全解釋器官缺血再灌注損傷的原因，是否存在其他的機制目前尚不清楚。

免疫反應(yīng)介導的機制在缺血再灌注損傷中的作用越來越受到重視[7-8]。一般認為，在再灌注后早期，抗缺血再灌注損傷的組織免疫反應(yīng)是以非特異性免疫反應(yīng)為主的炎癥反應(yīng)，而以T細胞激活為標志的特異性免疫反應(yīng)在再灌注后晚期發(fā)揮作用；活化的T細胞通過兩種主要的機制發(fā)揮功能，即分泌細胞因子和細胞表面共刺激分子表達[2]。PD-1及其配體作為一種重要的共刺激分子，在缺血再灌注損傷中的作用得到越來越多的重視和研究。

3 PD-1/PD-L途徑在不同器官缺血再灌注損傷中的作用

3.1PD-1/PD-L途徑與腸缺血再灌注損傷 臨床上，腸缺血再灌注損傷通常發(fā)生在急性腸系膜缺血、嚴重創(chuàng)傷、出血性或感染性休克以及較大的外科手術(shù)之后[9]。腸缺血再灌注損傷引起腸道防御屏障受損，嚴重者可引起菌群失調(diào)以及細菌移位，并導致進展性遠端器官損害和多器官功能障礙綜合征而危及患者生命。腸道是人體最大的免疫器官，已有研究發(fā)現(xiàn)，腸上皮細胞作為非專職抗原呈遞細胞，可以表達PD-L1分子，與腸上皮間淋巴細胞相互作用，調(diào)節(jié)腸道免疫、影響腸道屏障功能；腸上皮細胞表達PD-L1在膿毒癥導致的腸屏障功能損傷中起重要作用[10]。關(guān)于PD-1及其配體與腸缺血再灌注損傷的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細胞制成的單細胞懸液能夠保護小鼠腸缺血再灌注損傷，而抗PD-L1單克隆抗體處理能消除脂肪間充質(zhì)干細胞單細胞懸液對小鼠腸缺血再灌注損傷的保護作用，提示PD-L1/PD-1信號通路在小鼠腸缺血再灌注損傷中有保護作用[11]。腸缺血再灌注破壞腸黏膜完整性和免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)A的產(chǎn)生。有研究表明，PD-1在調(diào)節(jié)腸道分泌型IgA中起重要作用[12]。另有研究觀察到小鼠腸缺血再灌注后Peyer′s結(jié)CD4+T細胞PD-1和PD-L1表達減少，且PD-1/PD-L1表達減少與腸黏膜損傷增加和IgA水平降低有關(guān)；腸缺血再灌注抑制Peyer′s結(jié)CD4+T細胞表達PD-1/PD-L1，這種抑制作用與腸道免疫系統(tǒng)和機械屏障功能受損有關(guān)，提示CD4+T細胞表達PD-1/PD-L1可能參與腸缺血再灌注損傷的發(fā)病機制；這個結(jié)果與癌癥或膿毒癥一般增加PD-1/PD-L1表達不同，缺血再灌注損傷抑制PD-1系統(tǒng)，表明PD-1通路的激活可能減輕缺血再灌注損傷[13]。白細胞介素(interleukin，IL)-10是一種具有廣泛免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子，主要由單核細胞和CD4+T淋巴細胞產(chǎn)生；此外，IL-10通過抑制微RNA(microRNA，miRNA/miR)-155調(diào)節(jié)激活誘導的胞苷脫氨酶(activation-induced cytidine deaminase，AID)，而AID是腸道Ig合成和抗菌功能的關(guān)鍵酶[14]。PD-1激活能調(diào)節(jié)IL-10釋放。研究發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注損傷導致PD-1表達減少、IgA、IgM的細菌結(jié)合能力受損，PD-L1融合Ig可激活PD-1，促進IL-10合成，降低miR-155水平，促進AID表達，降低了腫瘤壞死因子-α、IL-1β水平，改善了IgA、IgM功能障礙引起的腸免疫屏障的破壞[5]。該研究結(jié)果首次證實腸缺血再灌注損傷后PD-1的激活可能通過調(diào)節(jié)IL-10/miR-155的產(chǎn)生而改善腸道免疫功能障礙。上述研究不僅證實了PD-1及其配體在腸道缺血再灌注損傷中的作用，也為缺血再灌注損傷引起腸屏障和免疫功能損害提供了新的潛在治療靶點。

3.2PD-1/PD-L途徑與腦缺血再灌注損傷 大腦是人體最重要的器官，也是對缺氧最為敏感的器官。腦缺血再灌注損傷是急性缺血性腦卒中重要的病理生理機制之一。缺血性腦卒中發(fā)病機制復雜，可誘導涉及多種免疫細胞的局部炎癥反應(yīng)。一般來說，腦內(nèi)炎癥免疫細胞的聚集加重了腦卒中的嚴重程度，這一過程在一定程度上依賴于T細胞的活化[15]。針對淋巴細胞黏附受體的抗體能阻斷T細胞遷移，并減小大鼠短暫性大腦中動脈閉塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)后第1天的腦梗死體積[16]。但T細胞通過何種機制參與缺血性腦卒中的病理生理過程尚不清楚，其中B7家族共刺激分子可能起著關(guān)鍵性的作用。Kleinschnitz等[17]最早用T細胞受體(T-cell receptor，TCR) 轉(zhuǎn)基因小鼠和共刺激分子突變小鼠確定了T細胞介導缺血再灌注腦損傷的最低免疫需求，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，完全缺乏成熟T細胞和B細胞的RAG1-/-小鼠和B細胞重建的RAG1-/-小鼠在60 min tMCAO和再灌注24 h后，腦梗死體積顯著減小，且缺血性腦卒中急性期T細胞的有害作用與T細胞驅(qū)動的獲得性免疫機制無關(guān)；與TCR的作用類似，無CD28、PD-L1和PD-1表達的小鼠在tMCAO后24 h的腦梗死體積及神經(jīng)功能缺損與野生型動物相當，表明通過PD-1/PD-L1或CD28/B7途徑的輔助TCR信號對于早期腦卒中的進展也不是必需的；該研究認為，T細胞在缺血性腦卒中中起關(guān)鍵作用，其有害作用在腦卒中早期不依賴于抗原識別，也不依賴于TCR共刺激信號。與此結(jié)果相反，隨后的另一項研究發(fā)現(xiàn)，PD-1通路在限制腦梗死體積、從周圍募集炎癥細胞、激活巨噬細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞以及神經(jīng)功能缺損等方面有調(diào)節(jié)作用；該研究認為，PD-1信號通路是大腦缺血再灌注損傷后限制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的主要保護途徑，這一抑制通路可能在減少腦卒中相關(guān)的Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)2和TLR4介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞激活并釋放神經(jīng)毒性因子中起關(guān)鍵作用[18]。然而，對于PD-L，有研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1-/-和PD-L2-/-小鼠的總梗死體積小于野生型小鼠，PD-L1-/-和PD-L2-/-小鼠可降低缺血腦半球具有促炎活性的小膠質(zhì)細胞和(或)單核細胞及CD4+T細胞的浸潤水平；在缺乏PD-L1的情況下，與缺血相關(guān)的脾萎縮減少，同時脾臟T細胞和單核細胞的激活狀態(tài)降低，表明PD-L在腦缺血再灌注損傷中具有致病作用而不是保護作用[19]。

缺血性腦卒中后不久，血漿和腦中性粒細胞源性的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)水平升高，MMP-9通過降解細胞外基質(zhì)破壞血腦屏障。研究發(fā)現(xiàn)，過繼轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)通過抑制MMP-9減輕急性缺血性腦損傷和保護血腦屏障[20]。但Treg細胞與中性粒細胞相互作用的具體機制尚不清楚。Li等[21]評估了PD-L1在腦缺血再灌注損傷后Treg細胞介導的中性粒細胞抑制和神經(jīng)保護中的作用，通過在體和體外研究證實PD-L1通過介導Treg細胞對中性粒細胞源性MMP-9的抑制作用，在Treg細胞抗腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護中起重要作用。上述研究的不同結(jié)果表明，PD-1/PD-L途徑對腦缺血再灌注損傷的作用尚存在爭議，不同細胞表達的特異性作用可能是存在不同作用的原因之一，需要更多的研究闡明其機制。

3.3PD-1/PD-L途徑與腎缺血再灌注損傷 急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)在住院患者中有較高的發(fā)病率和病死率，增加了慢性腎臟病和終末期腎臟病發(fā)生的可能性。腎缺血再灌注損傷是AKI發(fā)生的主要原因之一，其特點是腎臟炎癥失控和腎小管上皮細胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腎缺血再灌注損傷模型中，Treg細胞減少導致腎臟非特異性免疫反應(yīng)和急性腎小管壞死(acute tubular necrosis，ATN)增加以及腎臟功能喪失[22]，相比之下，缺血前增加Treg細胞能保護腎臟免受炎癥和ATN侵害，并能保護腎功能[23]。但Treg細胞移植與腎缺血再灌注損傷相關(guān)的非特異性免疫反應(yīng)機制目前尚不清楚。Treg細胞表達CD73，CD73是參與細胞外腺苷生成的最后一種酶，腺苷通過激活免疫細胞上的腺苷2A受體抑制炎癥反應(yīng)，保護缺血再灌注后的腎功能[24]。Kinsey等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Treg細胞同時產(chǎn)生和應(yīng)答腺苷的能力是其抑制腎缺血再灌注損傷非特異性免疫反應(yīng)所必需的，Treg細胞通過自分泌的方式增加PD-1表達，進而抑制非特異性免疫反應(yīng)，保護腎缺血再灌注損傷，該研究首次揭示了PD-1與腎缺血再灌注損傷的關(guān)系。隨后，有研究發(fā)現(xiàn)，在輕、中度腎臟缺血再灌注前使用PD-L1或PD-L2阻斷抗體可顯著加重腎功能損傷、腎臟炎癥和ATN，兩種配體同時阻斷較單獨阻斷任何一個配體會導致更嚴重的腎損傷；PD-L1或PD-L2基因缺陷也會加重缺血再灌注后的腎功能障礙和ATN，PD-L1在非骨髓來源的細胞上表達是其保護腎缺血再灌注損傷的關(guān)鍵，而且阻斷PD-L1或PD-L2同樣可逆轉(zhuǎn)過繼轉(zhuǎn)移Treg細胞對腎缺血再灌注損傷的保護作用[26]。這些結(jié)果提示，與PD-1一樣，PD-L1和PD-L2在腎缺血再灌注損傷的自身保護反應(yīng)方面至關(guān)重要，可能是AKI新的治療靶點。

3.4PD-1/PD-L途徑與心肌缺血再灌注損傷 心血管疾病常年處于人類致死性疾病的首位，尤其是心肌梗死，具有高病死率和心力衰竭發(fā)生風險，關(guān)鍵病理因素之一就是心肌梗死患者在血運重建治療中伴隨的心肌缺血再灌注損傷。心肌缺血再灌注損傷指冠狀動脈部分或完全急性阻塞后，在一定時間又重新獲得再通時，缺血心肌雖然得以恢復正常灌注，但其組織損傷反而呈進行性加重的病理過程。缺血期引起的心肌超微結(jié)構(gòu)、能量代謝、心功能和電生理等一系列損傷性變化，在血管再通后表現(xiàn)得更為突出，甚至可發(fā)生嚴重的心律失常而導致猝死。

關(guān)于PD-1/PD-L通路與心肌缺血再灌注損傷的關(guān)系，F(xiàn)orteza等[27]分析了PD-1/PD-L通路在ST段抬高型心肌梗死中的作用，發(fā)現(xiàn)外周血單個核細胞中PD-1的表達水平先升高后降低，且PD-1在心肌梗死區(qū)的表達顯著增加，提示PD-1可能在T細胞的轉(zhuǎn)運和對心肌損傷的影響中起調(diào)節(jié)作用；研究還發(fā)現(xiàn)，在外周血單個核細胞中，心肌梗死面積與PD-1的表達顯著相關(guān)，心肌梗死范圍越大，PD-1表達下調(diào)越嚴重，提示PD-1通路激活可能對缺血再灌注心肌具有保護作用。該研究首次發(fā)現(xiàn)了PD-1在下調(diào)ST段抬高型心肌梗死急性炎癥反應(yīng)中的作用。

內(nèi)源性炎癥機制是導致心肌損傷的重要原因。生長停滯和DNA損傷誘導蛋白153(growth arrest and DNA damage inducible protein 153，GADD153)可調(diào)節(jié)心臟炎癥反應(yīng)和心肌細胞凋亡，GADD153的表達與心肌損傷有關(guān)[28]。Baban等[29]研究發(fā)現(xiàn)，離體缺血再灌注心肌細胞PD-1和PD-L1的表達顯著增加，但免疫熒光研究顯示，PD-1和PD-L1并非主要在同一心肌細胞上共同表達；PD-1/PD-L1表達上調(diào)與GADD153和IL-17水平顯著升高、IL-10水平輕度升高有關(guān)，也與線粒體膜電位中斷以及細胞凋亡有關(guān)，PD-L1阻斷抗體治療能逆轉(zhuǎn)上述改變，表現(xiàn)出顯著的心臟保護作用；此外，缺血再灌注心肌細胞能抑制T淋巴細胞增殖，這一作用也可被PD-L1抗體部分逆轉(zhuǎn)。該研究結(jié)果表明，心肌缺血再灌注時PD-1/PD-L1通路上調(diào)可能通過旁分泌機制介導心肌組織損傷。缺血再灌注心肌細胞抑制T細胞增殖與PD-1/PD-L1途徑的負性免疫調(diào)節(jié)作用相一致，反映了心臟通過抑制浸潤的免疫細胞減輕心肌損傷的一種內(nèi)源性機制，這一機制作用的強弱可能決定了心肌損傷的程度。

3.5PD-1/PD-L途徑與肝缺血再灌注損傷 肝缺血再灌注損傷是一種外源性抗原非依賴性的炎癥事件，可發(fā)生在多種臨床環(huán)境中，包括部分肝切除、肝臟創(chuàng)傷和肝移植等。肝缺血再灌注損傷仍然是肝移植患者最嚴重的問題之一，不僅可造成10%的早期移植失敗，還可導致較高的急性和慢性排斥反應(yīng)發(fā)生率，并導致肝臟供體的急性短缺[30]。

研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細胞介導了非特異性免疫反應(yīng)主導的肝臟缺血再灌注損傷[31]，但具體機制目前尚不清楚。Ji等[32]利用小鼠部分肝臟熱缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)阻斷PD-1信號通路會加重缺血再灌注后肝細胞的損傷，而激活PD-1信號通路可保護肝臟免受缺血再灌注侵害，其作用機制包括減少肝內(nèi)T淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞浸潤及激活，減少細胞凋亡，減少促炎癥趨化因子和細胞因子的基因表達而選擇性增加抗炎癥細胞因子IL-10的表達等；研究還發(fā)現(xiàn)，中和IL-10不僅能導致肝缺血再灌注損傷，還可逆轉(zhuǎn)PD-L1 Ig對肝缺血再灌注損傷的治療作用；該研究首次證實了PD-1/PD-L1通路在肝缺血再灌注損傷中的重要作用，刺激PD-1信號通過抑制T細胞活化和庫普弗細胞/巨噬細胞功能而改善肝臟缺血再灌注損傷；PD-1對T細胞-庫普弗細胞相互作用的負性協(xié)同刺激機制可能是通過減少器官損傷和促進IL-10依賴的細胞保護作用來維持肝臟的穩(wěn)態(tài)。

Ueki等[33]利用PD-L1基因敲除小鼠，在肝臟冷缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，移植肝組織PD-L1的表達在肝缺血再灌注損傷過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用；臨床移植肝組織標本分析也顯示，PD-L1在人體移植肝上的表達與正常肝組織相比顯著增加[33]。由此認為，移植肝PD-L1的表達在移植肝冷缺血再灌注損傷中通過調(diào)節(jié)非特異性免疫反應(yīng)起重要的保護作用。

4 小 結(jié)

隨著對PD-1/PD-L1作用機制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1作為免疫檢查點抑制劑用于腫瘤免疫治療是目前腫瘤治療領(lǐng)域最有前景的研究方向[34]，而對PD-1/PD-L1在器官缺血再灌注損傷中的作用尚處于實驗研究階段。通過觀察PD-1/PD-L1在器官缺血再灌注損傷時的表達變化、使用基因敲除小鼠、PD-L1 Ig激活或單克隆抗體阻斷PD-1/PD-L1通路等多種方式證實PD-1/PD-L1可通過調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)減輕器官的缺血再灌注損傷，但目前相關(guān)機制研究尚不深入，且在心肌梗死及缺血性腦卒中發(fā)病機制中的作用還存在爭議，尚需更多的實驗和臨床研究證實其作為器官缺血再灌注損傷治療靶點的可能。