胡 萍,張雙英,李 潔,雷琪琪,張文檸,敖寧建,*
(1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣東 廣州 510632;2.廣東省教育廳生物材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510632)
殼聚糖(CS)因其良好的生物相容性,成為了神經(jīng)組織工程中重要的生物高分子材料[1-3]。研究表明,以殼聚糖為基底物質(zhì)構(gòu)建組織工程支架對(duì)神經(jīng)修復(fù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4-13],但是單純的殼聚糖支架在水化狀態(tài)下不能為細(xì)胞提供良好的生長環(huán)境,所以常用化學(xué)交聯(lián)劑對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性[9]。京尼平作為一種性能優(yōu)良的天然生物交聯(lián)劑,在交聯(lián)過程中產(chǎn)生的毒性遠(yuǎn)小于戊二醛,還能減少炎癥的發(fā)生[14]。然而,僅用京尼平交聯(lián)的殼聚糖支架并不能很好地促進(jìn)細(xì)胞定向生長和分化。趙玉園[15]利用靜電紡絲技術(shù)制備的PLLA/ SAP生物支架能為神經(jīng)干細(xì)胞提供更加穩(wěn)定的生長環(huán)境,并且能夠誘導(dǎo)神經(jīng)軸突的伸長。鑒于此,作者利用天然生物交聯(lián)劑京尼平交聯(lián)CS和功能性自組裝多肽(F-SAP),經(jīng)冷凍干燥制備不同配比的CS/F-SAP復(fù)合支架;通過比較復(fù)合支架的微觀形貌、孔隙率、力學(xué)性能和吸水率確定復(fù)合支架的最佳配比;通過研究復(fù)合支架對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響探究其對(duì)神經(jīng)再生的作用。
京尼平、牛血清白蛋白(BSA),百靈威科技有限公司;殼聚糖、PDL、兔源-GFAP、Alexa Fluor 488-Phalloidi,Sigma-Aldrich公司;DMEM/F12、EGF、BFGF、B27(含VA)、B27(不含VA)、N2、Accutase,GIBCO公司;抗鼠源-Tubulin-β,Bio Legend公司;Alexa Fluor 546二抗,Invitrogen公司;Triton X-100,Amresco公司;含DAPI的熒光保護(hù)劑,Electron Microscopy Science公司。
EQIOMOX55型傅立葉紅外光譜儀、ULTRA55型掃描電子顯微鏡、LSM700型激光共聚焦顯微鏡,Carl Zeiss公司;冷凍干燥機(jī),五洲東方科技有限公司。
配制20 mg·mL-1的CS溶液(pH=5.5)和10 mg·mL-1的F-SAP溶液(pH=7),采用化學(xué)交聯(lián)法制備CS/F-SAP復(fù)合支架。將CS溶液與F-SAP溶液分別按體積比3∶1、1∶1、1∶3混合均勻,再將各組混合液與2 mg·mL-1的京尼平溶液按體積比3∶1混合,振蕩均勻,加入24孔板中,冷凍干燥,即得CS/F-SAP復(fù)合支架,分別標(biāo)記為CS/F-SAP-1、CS/F-SAP-2、CS/F-SAP-3。不添加F-SAP溶液,同法制備CS支架作為對(duì)照。
將CS/F-SAP復(fù)合支架冷凍干燥24 h后,粘附在導(dǎo)電板上并涂金,采用掃描電子顯微鏡觀察其微觀形貌。
稱量CS/F-SAP復(fù)合支架的質(zhì)量(m0);將其放入盛滿乙醇的比重瓶中,稱量比重瓶的質(zhì)量(m1);再脫氣,加滿乙醇,稱量乙醇和比重瓶的質(zhì)量(m2);最后將復(fù)合支架取出,稱量剩余乙醇和比重瓶的質(zhì)量(m3),按式(1)計(jì)算孔隙率:
(1)
將CS/F-SAP復(fù)合支架冷凍干燥24 h,利用電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)其進(jìn)行壓縮,繪制CS/F-SAP復(fù)合支架的壓縮應(yīng)力應(yīng)變曲線。
稱量CS/F-SAP復(fù)合支架的質(zhì)量(m0);將其放入PBS緩沖液中浸泡3 min后取出,用濾紙吸去復(fù)合支架表面多余的水分后稱量質(zhì)量(m4),按式(2)計(jì)算吸水率:
(2)
采用維持培養(yǎng)基將懷孕14.5 d的C57胎鼠鼠腦源神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)7 d;用Accutase消化神經(jīng)球,使細(xì)胞呈單個(gè)狀態(tài),以合適的密度接種到支架表面;再將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱,采用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d。其中培養(yǎng)箱的溫度為37 ℃,CO2濃度為5%。
維持培養(yǎng)基配方:DMEM/F12培養(yǎng)基、1%雙抗、1%谷氨酰胺、2% B27(不含VA)、1% N2、20 ng·mL-1BFGF、0.1%肝素。
分化培養(yǎng)基配方:DMEM/F12培養(yǎng)基、1%FBS、1%雙抗、1% B27(含VA)。
將在支架中培養(yǎng)7 d后的神經(jīng)干細(xì)胞用多聚甲醛(4%)固定15 min,再用Triton X-100(0.1%)和含有BSA(3%)的PBS緩沖液封閉30 min;用抗鼠源-Tubulin-β標(biāo)記神經(jīng)元,兔源-GFAP標(biāo)記星型膠質(zhì)細(xì)胞;將Alexa Fluor 546(驢抗鼠)和Alexa Fluor 488(驢抗兔)溶解在PBS緩沖液中,常溫避光反應(yīng)2 h;用DAPI(1∶1000)染色細(xì)胞核,避光反應(yīng)10 min,置于激光共聚焦顯微鏡中觀察。將包被了PDL的玻片作為對(duì)照組。
a.CS b.CS/F-SAP-1 c.CS/F-SAP-2 d.CS/F-SAP-3
從圖1可以看出,CS支架和不同配比的CS/F-SAP復(fù)合支架均具有多孔結(jié)構(gòu),說明F-SAP的加入不影響CS支架的多孔結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)?,CS和F-SAP帶有相同的電荷,交聯(lián)前彼此分散,無團(tuán)聚現(xiàn)象。研究[16]表明,材料的多孔結(jié)構(gòu)可以為細(xì)胞提供更大的粘附空間。
圖2 CS/F-SAP復(fù)合支架的孔隙率Fig.2 Porosity of CS/F-SAP composite scaffolds
從圖2可以看出,復(fù)合支架的孔隙率隨著F-SAP比例的增大逐漸升高,但增幅較小。其中,CS支架的孔隙率為(90±0.98)%,CS/F-SAP-1、CS/F-SAP-2、CS/F-SAP-3復(fù)合支架的孔隙率分別為(96±0.75)%、(98±0.50)%、(98±0.58)%。這是因?yàn)?,隨著CS/F-SAP復(fù)合支架中F-SAP比例的增大,CS所占比例減小,使得交聯(lián)點(diǎn)的密度減小,導(dǎo)致孔隙率升高。
CS/F-SAP復(fù)合支架的壓縮應(yīng)力應(yīng)變曲線如圖3所示。
圖3 CS/F-SAP復(fù)合支架的壓縮應(yīng)力應(yīng)變曲線Fig.3 Compressive stress-strain curves of CS/F-SAP composite scaffolds
從圖3可以看出,復(fù)合支架的力學(xué)強(qiáng)度隨著F-SAP比例的增大有所減小,但減幅不大。其中,CS支架的力學(xué)強(qiáng)度最好,CS/F-SAP-1復(fù)合支架和CS/F-SAP-2復(fù)合支架的力學(xué)強(qiáng)度適中,CS/F-SAP-3復(fù)合支架的力學(xué)強(qiáng)度最差。這是因?yàn)?,隨著CS/F-SAP復(fù)合支架中F-SAP比例的增大,CS所占比例減小,使得交聯(lián)點(diǎn)的密度減小,導(dǎo)致交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)械強(qiáng)度降低。
此外,多孔支架的壓縮應(yīng)變由材料本身決定。這表明,可以通過改變CS與F-SAP的比例來調(diào)節(jié)復(fù)合支架的機(jī)械強(qiáng)度。
圖4 CS/F-SAP復(fù)合支架的吸水率Fig.4 Water absorption of CS/F-SAP composite scaffolds
從圖4可以看出,F(xiàn)-SAP在復(fù)合支架中的比例對(duì)復(fù)合支架的吸水率影響較大,復(fù)合支架的吸水率隨著F-SAP比例的增大而升高。其中,CS支架的吸水率為(226±1.38)%,CS/F-SAP-1、CS/F-SAP-2、CS/F-SAP-3復(fù)合支架的吸水率分別為(236±1.75)%、(291±1.59)%、(305±1.73)%。表明,CS/F-SAP-2復(fù)合支架和CS/F-SAP-3復(fù)合支架的吸水率都較高。這是因?yàn)?,隨著CS/F-SAP復(fù)合支架中F-SAP比例的增大,CS所占比例減小,三維網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)點(diǎn)的密度也隨之減小,使得水分子更容易進(jìn)入支架網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致吸水率升高。
綜上,CS/F-SAP-2復(fù)合支架和CS/F-SAP-3復(fù)合支架的孔隙率和吸水率都較高,但是CS/F-SAP-3復(fù)合支架交聯(lián)點(diǎn)的密度較小,機(jī)械強(qiáng)度較低。因此,選擇CS/F-SAP-2復(fù)合支架為最佳材料,即制備CS/F-SAP復(fù)合支架最佳CS溶液與F-SAP溶液的體積比為1∶1。
神經(jīng)干細(xì)胞具有多向分化的功能,可以分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[17],具有可塑性強(qiáng)、遷移率高和免疫原性低等特點(diǎn)。在神經(jīng)損傷修復(fù)過程中,神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞相互調(diào)控,兩者以正反饋的方式促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[18]。研究[19]表明,神經(jīng)損失后7 d,星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量約增加8%。在免疫熒光染色的研究中,顯示了神經(jīng)元和軸突的密度。神經(jīng)干細(xì)胞在支架中培養(yǎng)7 d后的免疫熒光照片如圖5所示。
a.CS/F-SAP-2 b.CS c.PDL
從圖5可以看出,CS/F-SAP-2復(fù)合支架相比于其它兩組支架,對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的分化效果更好,神經(jīng)元和軸突的密度更大。表明,CS/F-SAP-2復(fù)合支架可以有效改善神經(jīng)的微結(jié)構(gòu)修復(fù)。此外,通過計(jì)數(shù)軟件Image-J計(jì)算神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比,結(jié)果如圖6所示。
a.神經(jīng)元分化比例 b.星型膠質(zhì)細(xì)胞分化比例
從圖6a可以看出,相比于其它兩組,CS/F-SAP-2復(fù)合支架中神經(jīng)元分化比例最大,說明CS/F-SAP-2復(fù)合支架有利于神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。同時(shí),從圖6b可以看出,相比于其它兩組,CS/F-SAP-2復(fù)合支架中星型膠質(zhì)細(xì)胞分化比例最小,也證明了CS/F-SAP-2復(fù)合支架能夠抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞的分化,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞更多地向神經(jīng)元方向分化,有利于神經(jīng)再生。
利用天然生物交聯(lián)劑京尼平交聯(lián)CS和F-SAP,經(jīng)冷凍干燥制備了不同配比的CS/F-SAP復(fù)合支架,通過比較復(fù)合支架的微觀形貌、孔隙率、力學(xué)性能和吸水率確定制備復(fù)合支架的最佳配比:20 mg·mL-1CS溶液與10 mg·mL-1F-SAP溶液的體積比為1∶1。最佳配比下制備的CS/F-SAP復(fù)合支架能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化,促進(jìn)神經(jīng)再生。