響應(yīng)面法優(yōu)化苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量

呂亭亭，楊志華，韓永紅，孟 鑫，陶 娟，劉 旭*

(1.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院藥學(xué)與中藥學(xué)院，江蘇 淮安 223005；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381)

泡桐，屬于玄參科泡桐屬雙子葉植物，其資源豐富，分布廣泛，種類繁多，主要是白花泡桐、毛泡桐、光葉泡桐等，在黃河流域被用作傳統(tǒng)醫(yī)藥數(shù)百年[1]。研究發(fā)現(xiàn)，泡桐植物的根、花、葉、皮、果均可入藥，具有抗氧化[2]、抗菌[3-4]、抗病毒[5]等藥理活性。泡桐花(Paulowniaeflos)即為泡桐的花，主要含有黃酮類、多糖、生物堿、有機(jī)酸、氨基酸等活性成分，具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱、燥濕止痢、清肝明目等功能[6-7]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，從泡桐花中提取的多糖，在增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗炎、調(diào)血脂、降血糖和抗衰老等方面具有顯著的生物活性[8-9]，受到研究者的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)階段，測定多糖含量的方法主要有色譜法和比色法。色譜法操作繁瑣、過程復(fù)雜，很少單獨用于多糖含量的測定；而苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等比色法由于操作簡單、實用性強(qiáng)，在多糖研究中應(yīng)用廣泛[10-13]。研究發(fā)現(xiàn)，苯酚-硫酸法在穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性上均優(yōu)于蒽酮-硫酸法[14-16]。鑒于此，作者選擇苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量，首先對苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量的方法學(xué)進(jìn)行驗證，然后在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇苯酚用量、硫酸用量和顯色時間為變量進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken實驗設(shè)計，通過響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化顯色條件，在最佳條件下測定泡桐花多糖含量，以期為泡桐花多糖的開發(fā)應(yīng)用提供檢測依據(jù)[17-18]。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

泡桐花，產(chǎn)自河南蘭考，將干燥后的泡桐花用多功能粉碎機(jī)粉碎成300目，備用。

乙醇、苯酚、硫酸均為分析純，無錫亞盛化工有限公司。

BF-10型多功能粉碎機(jī)，河北本辰科技有限公司；UV1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；BSA型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；PS-60型超聲波清洗器，蘇州創(chuàng)惠電子有限公司。

1.2 泡桐花的預(yù)處理

稱取泡桐花粉末30.0 g，石油醚脫脂[19]，過濾，濾渣置于60 ℃烘箱烘干；加入600 mL 80%乙醇加熱回流處理，以除去黃酮類物質(zhì)，過濾，濾渣置于60 ℃烘箱烘干，稱定，儲存，備用。

1.3 溶液的配制

1.3.1 苯酚溶液的配制

稱取苯酚2.5 g，置于50 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水在超聲輔助作用下溶解，定容，放入冰箱，避光保存，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取適量的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加蒸餾水溶解，配制成0.1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液[20-21]。

1.3.3 供試溶液的配制

稱取預(yù)處理后的泡桐花粉末2.0 g，加入40 mL蒸餾水，稱定；70 ℃回流1 h，冷卻，再次稱定，用蒸餾水補(bǔ)足失重；離心，取20 mL上清液，邊攪拌邊滴加無水乙醇80 mL，靜置20 h；離心，棄去上清液，沉淀用蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，作為供試儲備液。精密量取5 mL供試儲備液，置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，作為供試溶液。

1.4 苯酚-硫酸法單因素實驗

量取2 mL供試溶液，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。分別考察苯酚用量(0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL)、硫酸用量(1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、9.0 mL)、水浴溫度(25 ℃、40 ℃、55 ℃、70 ℃、85 ℃、100 ℃)及顯色時間(10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)對吸光度的影響。

1.5 苯酚-硫酸法響應(yīng)面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取苯酚用量(A)、硫酸用量(B)、顯色時間(C)3個因素為自變量，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計實驗，并應(yīng)用響應(yīng)面法對苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量的條件進(jìn)行優(yōu)化。Box-Behnken設(shè)計實驗的因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計實驗的因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

分別量取供試溶液、0.04 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和蒸餾水各2.0 mL，置于具塞試管中，按照苯酚-硫酸法顯色條件顯色，迅速冰浴冷卻，用紫外可見分光光度計在400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，測定最大吸收波長，結(jié)果如圖1所示。

圖1 吸光度-波長曲線Fig.1 Absorbance-wavelength curves

從圖1可知，泡桐花多糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長均為490 nm。因此，選擇490 nm作為檢測波長。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性方程與檢測范圍

精密量取1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL的0.1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加蒸餾水稀釋至10 mL，搖勻。精密量取2.0 mL供試溶液置于具塞試管中，按照苯酚-硫酸法顯色條件顯色，取出，迅速冰浴冷卻；另取2.0 mL蒸餾水同法操作，空白調(diào)零，測定溶液在490 nm處吸光度，以葡萄糖濃度(x，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，擬合得到線性方程y=11.202x+0.0145，R=0.9993。表明，葡萄糖濃度在0.01～0.08 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.2.2 重復(fù)性

精密稱取6份預(yù)處理后的泡桐花粉末2.0 g，按1.3.3方法制備供試溶液，苯酚-硫酸法顯色，用紫外可見分光光度計測定490 nm處吸光度，每份樣品平行測定3次，計算泡桐花多糖含量及RSD，結(jié)果見表2。

從表2可知，泡桐花多糖的平均含量為2.48%，RSD為1.2%，小于1.5%，符合藥典規(guī)定，表明該方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性實驗結(jié)果

2.2.3 日間精密度

精密稱取預(yù)處理后的泡桐花粉末2.0 g，按1.3.3方法每天制備一份供試溶液，共6份，苯酚-硫酸法顯色，用紫外可見分光光度計測定490 nm處吸光度，每份樣品平行測定3次，計算泡桐花多糖含量及RSD，結(jié)果見表3。

表3 日間精密度實驗結(jié)果

從表3可知，泡桐花多糖的平均含量為2.58%，RSD為1.3%，小于1.5%，符合藥典規(guī)定，表明該方法日間精密度良好。

2.2.4 加標(biāo)回收率

精密稱取預(yù)處理后的泡桐花粉末2.0 g，按1.3.3方法制備供試溶液，再分別加入相當(dāng)于2.0 g樣品中所含葡萄糖50%、100%和150%的標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度平行制備3份樣品，苯酚-硫酸法顯色，用紫外可見分光光度計測定490 nm處吸光度，每份樣品平行測定3次，計算泡桐花多糖的加標(biāo)回收率及RSD，結(jié)果見表4。

從表4可知，泡桐花多糖的加標(biāo)回收率在98.94%～101.93%之間，低、中、高濃度的RSD分別為1.0%、1.4%、1.2%，符合藥典規(guī)定，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性

精密稱取預(yù)處理后的泡桐花粉末2.0 g，按1.3.3方法制備供試溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h取樣測定490 nm處吸光度，每份樣品平行測定3次，計算得到泡桐花多糖含量分別為2.62%、

表4 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果

2.61%、2.66%、2.67%、2.64%、2.63%、2.65%，平均含量為2.64%，RSD為0.82%，小于1.5%，表明該供試溶液在0～12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 苯酚-硫酸法單因素實驗結(jié)果

2.3.1 苯酚用量對吸光度的影響(圖3)

圖3 苯酚用量對吸光度的影響Fig.3 Effect of phenol amount on absorbance

從圖3可知，苯酚用量在0.2～1.0 mL范圍內(nèi)時，吸光度先增大后減小，在苯酚用量為0.4 mL時，吸光度最大。故最佳苯酚用量為0.4 mL左右。

2.3.2 硫酸用量對吸光度的影響(圖4)

圖4 硫酸用量對吸光度的影響Fig.4 Effect of sulfuric acid amount on absorbance

從圖4可知，硫酸用量在1.0～9.0 mL范圍內(nèi)時，吸光度先增大后減小，當(dāng)硫酸用量為5.0 mL時，吸光度最大。這是因為，硫酸用量過少時，多糖水解成單糖的程度不充分，導(dǎo)致吸光度偏?。欢蛩嵊昧窟^大時，生成的糖醛衍生物不穩(wěn)定、易分解，也會導(dǎo)致吸光度偏小。故最佳硫酸用量為5.0 mL左右。

2.3.3 水浴溫度對吸光度的影響(圖5)

圖5 水浴溫度對吸光度的影響Fig.5 Effect of water bath temperature on absorbance

從圖5可知，水浴溫度在25～100 ℃范圍內(nèi)時，吸光度先增大后減小，當(dāng)水浴溫度為40 ℃時，吸光度最大。故最佳水浴溫度為40 ℃。

2.3.4 顯色時間對吸光度的影響(圖6)

圖6 顯色時間對吸光度的影響Fig.6 Effect of coloration time on absorbance

從圖6可知，顯色時間在10～30 min范圍內(nèi)時，吸光度先增大后減小，當(dāng)顯色時間為25 min時，吸光度最大。故最佳顯色時間在25 min左右。

2.4 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken設(shè)計結(jié)果

采用Box-Behnken設(shè)計實驗，分別以苯酚用量(A)0.4 mL、硫酸用量(B)5.0 mL和顯色時間(C)25 min為中心點，進(jìn)行3因素3水平優(yōu)化實驗，結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken設(shè)計實驗結(jié)果

2.4.2 響應(yīng)面實驗?zāi)Ｐ图胺讲罘治?/p>

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得回歸方程模型：Y=2.83+0.14A+0.12B+0.036C+0.065AB+0.19AC-0.063BC-0.41A2-0.54B2-0.39C2。模型方差分析見表6。

表6 響應(yīng)面實驗?zāi)Ｐ头讲罘治?/p>

2.4.3 各因素間的交互作用

各因素間的交互作用對泡桐花多糖含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖7所示。

響應(yīng)面圖中圖形陡峭程度越大代表影響越大，反之越小[22]。從圖7可知，苯酚用量對泡桐花多糖含量的影響最大，硫酸用量次之，顯色時間的影響最小，這與表6的分析結(jié)果一致。等高線圖呈橢圓形，說明各因素的交互作用顯著，呈圓形則為交互作用不顯著[23]。從圖7還可知，苯酚用量和顯色時間之間的交互作用較顯著。

2.4.4 最佳條件的確定

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量的最佳條件為：苯酚用量0.42 mL、硫酸用量5.12 mL、顯色時間25.43 min，在此條件下，泡桐花多糖含量的預(yù)測值為2.85%?？紤]實際操作等因素，將最佳條件調(diào)整為：苯酚用量0.4 mL、硫酸用量5.0 mL、顯色時間25 min。

2.5 多糖含量測定

分別稱取6份預(yù)處理后的泡桐花粉末2.0 g，按1.3.3方法制備供試溶液，在苯酚用量為0.4 mL、硫酸用量為5.0 mL、顯色時間為25 min時進(jìn)行顯色反應(yīng)，每份樣品平行測定3次。計算得到泡桐花多糖的平均含量為2.65%，RSD為2.95%，表明優(yōu)化后的苯酚-硫酸法測定條件穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

對苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量的方法學(xué)進(jìn)行驗證，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇苯酚用量、硫酸用量和顯色時間為變量進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken設(shè)計實驗，通過響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化顯色條件，在最佳條件下測定泡桐花多糖含量。確定苯酚-硫酸法測定泡桐花多糖含量的最佳條件為：苯酚用量0.4 mL、硫酸用量5.0 mL、顯色時間25 min，在此條件下，泡桐花多糖平均含量為2.65%，RSD為2.95%，與預(yù)測值接近，說明優(yōu)化后的苯酚-硫酸法穩(wěn)定可靠，更加適用于泡桐花多糖含量的測定。

(a)苯酚用量和硫酸用量的交互作用 (b)苯酚用量和顯色時間的交互作用 (c)硫酸用量和顯色時間的交互作用