一株耐銅真菌HLKF-11的初步鑒定及銅富集能力測定

王黎明，劉作林，梅 林

(1.湖北環(huán)境修復(fù)與治理技術(shù)研究有限公司，湖北 黃石 435003；2.湖北理工學(xué)院，湖北 黃石 435003)

銅是一種生命必需的微量元素，但過量的銅會危害人和動物的健康。銅礦開采、煉銅、鍍銅等過程產(chǎn)生的“三廢”和銅制劑、含銅農(nóng)藥的大量使用，給礦業(yè)廢棄地及周邊土壤造成嚴(yán)重的銅污染，并通過食物鏈危害人體健康。研究開發(fā)科學(xué)、經(jīng)濟、有效的治理方法，是銅污染土壤修復(fù)領(lǐng)域關(guān)注的熱點。研究人員先后開發(fā)了物理修復(fù)和化學(xué)修復(fù)方法，如客土換土法、離子交換法、活性炭吸附法、化學(xué)沉淀法、電化學(xué)法和淋濾法等，這些方法能夠在較短時間內(nèi)去除土壤中的銅，具有一定的應(yīng)用效果，但存在投入較大、對環(huán)境擾動大、易造成二次污染以及難于開展大規(guī)模工程治理等不足[1]。近年來，以植物、動物及微生物為主體的生物修復(fù)技術(shù)因其成本較低、無二次污染和效果持久等優(yōu)勢，受到全球的普遍關(guān)注，被列為未來最有前途的重金屬污染治理技術(shù)[2]。

研究表明，銅礦區(qū)、銅污染土壤以及冶金和含銅化工廠排放污水中存在大量耐銅微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等[3]。傅冬和等[4]從養(yǎng)豬場周邊土壤中分離出1株耐銅真菌煙曲霉(Aspergillusfumigatus)，最高耐受銅濃度為940 mg·L-1，該菌對茶園土壤中的銅有一定的富集作用。張小菲等[5]從銅污染土壤中分離出1株耐銅節(jié)桿菌屬細(xì)菌，該菌在pH值5.0、30 ℃時處理低濃度銅污染廢水50 min，Cu2+吸附率達(dá)99.1%。柴新義等[6]從銅礦廠區(qū)土壤中篩選出1株高耐銅菌株，耐受銅濃度高達(dá)15 000 mg·L-1，經(jīng)馴化培養(yǎng)后其最高耐受銅濃度可達(dá)54 300 mg·L-1，該菌對Cu2+表現(xiàn)出極高的耐受性和吸附能力，成為微生物治理重金屬污染水體的優(yōu)良備選菌種。董新嬌[7]從電鍍廠廢水中分離出1株耐銅菌株，經(jīng)鑒定為枝孢霉菌(Cladosporiumsp.)，其最高耐受銅濃度可達(dá)720 mg·L-1。上述研究表明，由于長期的環(huán)境脅迫和自然選擇，銅污染環(huán)境中存在大量的耐銅微生物，通過分離篩選和脅迫培養(yǎng)，能夠獲得有效治理銅污染土壤的微生物資源。

銅綠山銅鐵礦是我國重要的銅礦開采、冶煉基地，長期的礦冶活動給當(dāng)?shù)氐耐寥涝斐闪藝?yán)重的銅污染。作者從銅綠山銅鐵礦廢棄露采場土壤中分離出1株耐銅真菌菌株HLKF-11，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和培養(yǎng)條件優(yōu)化，并在最適培養(yǎng)條件下探討菌株對銅的富集能力，為該菌株在銅污染土壤的生物修復(fù)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 土樣的采集與處理

土樣采自湖北大冶銅綠山銅鐵礦廢棄露采場南坑，剖面深度0～20 cm，以5 cm為1個梯度，用梅花五點法分別采集不同土壤剖面的土樣，置于干凈的裝樣瓶中，貼好標(biāo)簽帶回實驗室，置于4 ℃冰箱保存。

將不同土壤剖面土樣混合均勻，烘干，磨細(xì)過 80目篩。稱取1.0 g土樣，置于100 mL燒杯中，加入濃鹽酸和濃硝酸的混合液(3∶1，體積比)10 mL，置于消解爐上至完全消解。冷卻后用2%稀硝酸溶液定容至100 mL，用原子吸收光譜法(Varian AA240型原子吸收光譜儀)測定樣品銅含量，并計算土壤銅含量。

1.2 土樣稀釋液的制備

準(zhǔn)確稱取10 g土樣放入錐形瓶中，加入100 mL無菌水充分混合，置于恒溫?fù)u床中，30 ℃、120 r·min-1下振蕩15 min，使土樣均勻分散，得到土樣母液。取1 mL土樣母液上清液于試管中，加入9 mL無菌水混合后得到混合液A(10-1)；接著取1 mL混合液A于另一試管中，加入9 mL無菌水混合得到混合液B(10-2)；以此類推，將土樣上清液逐步稀釋，依次得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同濃度的土樣稀釋液。

1.3 耐銅真菌篩選培養(yǎng)基的制備

以馬丁培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基、CuSO4為篩選劑，制備耐銅真菌篩選培養(yǎng)基。具體方法是：按馬丁培養(yǎng)基的成分與用量稱取各組分，分別溶解于水中，每1 000 mL培養(yǎng)基添加3 mL孟加拉紅溶液，添加500 mg·L-1CuSO4溶液，待所有成分均溶解后，添加自來水至所需體積，調(diào)節(jié)溶液pH值；溶液混合均勻后加入瓊脂煮沸融化，裝瓶后滅菌；待培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右時，加入適量經(jīng)抽濾除菌的鏈霉素溶液振蕩混勻，倒平板冷卻凝固后備用。

1.4 耐銅真菌的分離、篩選

用涂布法將不同濃度土樣稀釋液分別涂布于耐銅真菌篩選培養(yǎng)基上，3次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每日觀察；挑取單菌落，分別轉(zhuǎn)接于新的平板中，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接、分離，最后得到1株耐銅真菌菌株HLKF-11。

1.5 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

顯微鏡下觀察菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)以及孢子形態(tài)等，做好記錄和拍照，并依據(jù)《真菌鑒定手冊》[8]鑒定菌株。

1.6 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

分別選擇pH值、溫度、碳源、氮源等進(jìn)行單因素實驗，優(yōu)化菌株HLKF-11的培養(yǎng)條件。

1.7 菌株對銅富集能力的測定

采用振蕩培養(yǎng)法。分別配制銅濃度(mg·L-1)為100、200、300、400、500、600、700的馬丁液體培養(yǎng)基，接種菌株HLKF-11的孢子液，在最適培養(yǎng)條件下160 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每隔24 h取樣一次，用原子吸收光譜法測定培養(yǎng)液上清液和菌絲(80 ℃烘干)的銅含量。3次重復(fù)，以不加銅為對照。按下式計算上清液和菌絲的銅含量：

上清液銅含量(mg·L-1)=L×50×250/50=250×L

(1)

菌絲銅含量(mg·g-1)=L×50×10-3/M=0.05×L/M

(2)

式中：L為測定的銅含量；M為菌絲質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 土樣的銅含量(表1)

表1 土樣的銅含量/(mg·kg-1)

由表1可知，土樣的銅含量較高，為1 154.7～3 393.0 mg·kg-1，平均銅含量為2 536.8 mg·kg-1，達(dá)到重度污染水平。研究表明，在一些重金屬含量高的采礦廢棄地，由于長期的重金屬脅迫選擇，一些對重金屬耐性強的植物、微生物在土壤中存活下來，表現(xiàn)出對重金屬的超富集特性[9]?？缔钡萚10]曾在此區(qū)域篩選到1株耐銅的芽孢桿菌TLSB2-K，其對Cu2+具有較強的富集能力。因此，選擇從礦業(yè)廢棄地土壤分離篩選重金屬耐性微生物成功率較高。

2.2 菌株HLKF-11的形態(tài)學(xué)鑒定(表2)

表2 菌株HLKF-11的形態(tài)特征

分析菌株HLKF-11的形態(tài)特征，參考《真菌鑒定手冊》[8]，初步確定菌株HLKF-11為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

2.3 菌株HLKF-11培養(yǎng)條件的優(yōu)化

研究pH值、溫度、碳源、氮源對菌株HLKF-11生長的影響，以培養(yǎng)96 h后平板上菌落直徑評價菌株的生長情況，結(jié)果見表3。

由表3可知，pH值為6.00～8.00時，菌落直徑都較大，其中以pH值6.50最為合適，菌落直徑達(dá)到8.85 cm；溫度在24～28 ℃范圍內(nèi)，菌株生長較好，其中以28 ℃時最為合適，菌落直徑達(dá)到9.24 cm；以蔗糖為碳源時，菌株生長最好，菌落直徑為8.32 cm；分別以硝酸銨、硝酸鉀和硫酸銨為氮源時，菌株均生長較好，其中硝酸銨為氮源時，菌株生長最好，菌落直徑達(dá)到8.65 cm。綜上，菌株HLKF-11的最適培養(yǎng)條件為：pH值6.50、溫度28 ℃、蔗糖為碳源、硝酸銨為氮源。

表3 pH值、溫度、碳源、氮源對菌株HLKF-11生長的影響

2.4 菌株HLKF-11對銅的富集能力

菌株HLKF-11對銅的富集量與培養(yǎng)液Cu2+初始濃度和培養(yǎng)時間密切相關(guān)。培養(yǎng)液Cu2+初始濃度、培養(yǎng)時間對菌株HLKF-11富集Cu2+量的影響見圖1。

圖1 培養(yǎng)液Cu2+初始濃度、培養(yǎng)時間對菌株HLKF-11富集Cu2+量的影響

由圖1可知，培養(yǎng)液Cu2+初始濃度在100～700 mg·L-1范圍內(nèi)，培養(yǎng)4 d內(nèi)，隨著Cu2+初始濃度的增加，菌株對Cu2+富集量基本呈上升趨勢；Cu2+初始濃度不同時，菌株對Cu2+最大富集量存在差異，Cu2+初始濃度為500 mg·L-1時，富集量最大，達(dá)到41.69 mg·g-1，明顯高于Cu2+初始濃度為600 mg·L-1和700 mg·L-1時的最大富集量(分別為17.2 mg·g-1和22.97 mg·g-1);培養(yǎng)4 d后，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株對Cu2+富集量整體呈下降趨勢，至第6 d時趨于穩(wěn)定。菌株HLKF-11對Cu2+富集量呈先升高后降低的可能原因是，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株對Cu2+的解吸速率大于吸附速率，富集量下降[11]。這表明，菌株HLKF-11 對Cu2+的富集是一個動態(tài)平衡過程，可以通過調(diào)控培養(yǎng)液Cu2+的初始濃度、培養(yǎng)時間優(yōu)化富集條件，獲得最優(yōu)的富集效果。

3 結(jié)論

以馬丁培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基、CuSO4為篩選劑，從大冶銅綠山銅鐵礦廢棄露采場土壤中分離得到1株耐銅真菌菌株HLKF-11，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，初步鑒定其為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。菌株HLKF-11以蔗糖為碳源、硝酸銨為氮源，在pH值為6.50、溫度為28 ℃時，生長最好。在培養(yǎng)液Cu2+初始濃度為100～700 mg·L-1時，菌株HLKF-11都能生長并富集Cu2+，其中以培養(yǎng)液Cu2+初始濃度為500 mg·L-1時，Cu2+富集量最大，達(dá)到41.69 mg·g-1。表明菌株HLKF-11對環(huán)境中的Cu2+具有較高的富集能力和耐受能力。該研究對進(jìn)一步豐富耐銅微生物資源以及應(yīng)用于銅污染土壤的生物修復(fù)具有一定的理論和實踐意義。