無患子皂苷抗炎抗菌功效研究

雷發(fā)玲，肖 蕾，么春艷，王增利

(1.無限極中國有限公司，廣東 新會 529156；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州 310013；3.健士星生物技術(shù)研發(fā)(上海)有限公司，上海 200335)

無患子(Sapindusmukorossi)是無患子科無患子屬落葉喬木，有木患子、油患子、洗手果等別稱，主要分布于我國長江流域及其以南各省區(qū)，在日本、東南亞等地區(qū)也有分布[1]。民間常用無患子的根和果入藥，其味苦微甘、微毒，具有清熱解毒、化痰止咳等功效[2]。無患子中含有豐富的三萜類皂苷成分[3]，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗高血壓、殺蟲、減少土壤中重金屬影響等多種活性[4-9]。此外無患子皂苷還是一種天然表面活性劑，具有良好的起泡性和去污性[10]，可用于美容護(hù)膚肥皂、洗發(fā)香波、潔膚護(hù)膚化妝品、日常洗滌以及餐具清潔產(chǎn)品中。無患子皂苷的特點使其在醫(yī)藥、化妝品及洗滌用品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著人們對自然的崇尚，天然抗菌劑和消炎劑的開發(fā)成為人們關(guān)注熱點。本研究通過佛波酯(TPA)誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹模型研究無患子皂苷的抗炎效果，并研究了無患子皂苷對環(huán)境常見致病菌的抑菌能力，為無患子皂苷作為天然抗炎劑和抗菌劑的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 試劑與儀器

1.1 材料與試劑

無患子藥材來源于福建漳浦大山苗木場，本研究使用的部位為無患子假種皮，將無患子果實去核后烘干，粉碎，過40目篩備用。

動物：ICR小鼠，SPF級，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供(實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2014-0001)，共48只，體重為18±2 g，全部為雄性。實驗動物于屏障系統(tǒng)下飼喂適應(yīng)環(huán)境5～7 d，適應(yīng)期結(jié)束時，體重25±2 g。

供試菌種：大腸桿菌(Escherichiacoli) ATCC8739；白色念珠菌(Moniliaalbicans)ATCC10231；黑曲霉(Aspergillusniger) ATCC16404；腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)CGMCC50760；肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)ATCC4352；乙型溶血鏈球菌(Streptococcushemolytis-β)ATCC21059；單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19114；須癬毛癬菌(Trichophytonmentagrophytes)BNCC340405；球孢枝孢菌(Cladosporiumsphaerospermum)CICC2505。

試劑：齊墩果酸(成都曼斯特生物科技有限公司)；乙醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、多聚甲醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。佛波酯(TPA)、TNF-α、IL-6、IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。培養(yǎng)基：MH培養(yǎng)基(酸水解酪蛋白17.5 g，可溶性淀粉1.5 g，牛肉浸出粉2 g)；PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，氯霉素0.1 g)。

1.2 試驗儀器

D101大孔樹脂(上海摩速科學(xué)儀器有限公司)；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)；Eclipse ci顯微鏡(日本尼康)；DS-FI2顯微成像系統(tǒng)(日本尼康)；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)；SW-CJ-1G型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；DNP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；ZDX-35SBI立式壓力蒸氣滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；WFZ UV-3802型紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 無患子總皂苷的制備

稱取無患子假種皮粉末1 kg，使用70%乙醇進(jìn)行提取，提取溫度為60℃，料液比1∶9，提取次數(shù)為3次，時間分別為：3 h、3 h和2 h。提取結(jié)束后抽濾除去藥渣，合并提取液，將提取液濃縮至無醇味，作為大孔樹脂上樣溶液進(jìn)行上樣，分別用水、30%、70% 醇依次洗脫，收集70%醇洗部位，濃縮至無醇味，即為無患子提取液。

無患子皂苷濃度的測定：配制1 mg/mL齊墩果酸-乙醇對照液10 mL，備用；配制5%香草醛-冰醋酸液10 mL，備用。分別取對照液20、40、60、80、100 μL，先后依次加入5%香草醛-冰醋酸液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，充分搖勻后于60℃水浴加熱15 min，取出后立即冰水冷卻3 min，加入5 mL冰醋酸，混勻，以不加對照液為空白組，在549 nm處測量吸光度，并根據(jù)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。無患子提取液稀釋100倍，取20 μL稀釋液按上述過程操作測得其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算無患子粗提液皂苷濃度。

2.2 抗炎模型建立與給藥方案

將 48只小鼠隨機分為6組，分別為空白組、模型組、陽性對照組(地塞米松，2.5 mg/kg)和無患子低劑量組(10 mg/mL)、中劑量組(20 mg/mL)、高劑量組(40 mg/mL)，每組8只。除空白組外，其余各組小鼠均于右耳內(nèi)外側(cè)涂抹 20 μL TPA致炎。并于造模同時，各給藥組小鼠均按每耳20 μL于右耳內(nèi)外側(cè)涂抹相應(yīng)藥液(以丙酮為溶劑)，空白組和模型組小鼠涂抹等體積丙酮溶液[11]。

2.3 小鼠耳腫脹程度的測定與病理切片

給藥6 h后，用數(shù)字測厚儀測量每只實驗動物左右耳的厚度，計算每只實驗動物左右耳的厚度差[12]。之后，將耳組織取樣并用 4%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋，切成10 μm的薄片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察各組小鼠耳組織病理學(xué)變化。

2.4 耳組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量測定

分別取同一部位耳組織，稱質(zhì)量，按質(zhì)量(g):體積(mL)= 1:9的比例加入生理鹽水，在冰浴條件下剪碎組織，制成 10%組織勻漿，然后以3000 r/min離心10 min，收集上清液，采用 ELISA 法檢測各組小鼠耳組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 供試菌種菌懸液制備

大腸桿菌、白色念珠菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、乙型溶血性鏈球菌、單增李斯特菌菌懸液的制備：取出菌種，復(fù)蘇并劃線于平板中，于37℃過夜培養(yǎng)。挑單菌落培養(yǎng)于液體 MH 培養(yǎng)基中(乙型溶血性鏈球菌接種于含5%去纖維綿羊血的MH培養(yǎng)基中)，于試驗前生長至對數(shù)生長期。利用比濁法稀釋制成108CFU/mL 的菌懸液，4℃?zhèn)溆谩?/p>

黑曲霉、須癬毛癬菌、球孢枝孢霉菌懸液的制備：取出菌種，復(fù)蘇并劃線于PDA平板中，25℃培養(yǎng) 5～7d直至長出孢子。用PDA液體培養(yǎng)基將孢子洗下，血球計數(shù)板計數(shù)，得到105個/mL的孢子懸液，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.6 最小抑菌濃度(MIC)測試

根據(jù)微量肉湯稀釋法[13]進(jìn)行，將待測無患子提取液用微孔濾膜過濾除菌，按照2倍稀釋法將其用待測菌種的無菌液體培養(yǎng)基稀釋成80～0.001 mg/mL的稀釋液。取微量稀釋板(96孔)，每孔加入50 μL不同濃度的稀釋樣品液和菌懸液50 μL，以不加樣品液且含菌的100 μL培養(yǎng)基作為對照，每組做3個平行。大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯菌、乙型溶血鏈球菌、單增李斯特菌在37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h，白色念珠菌在25℃條件下培養(yǎng)48 h，黑曲霉、須癬毛癬菌、球孢枝孢菌于25℃條件下培養(yǎng)7 d。觀察96孔板每個濃度孔中測試菌的生長情況，與對照孔比較，菌的生長完全被抑制，培養(yǎng)基清亮所對應(yīng)的最低藥物濃度值為無患子皂苷的最小抑菌濃度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 無患子提取液皂苷含量

經(jīng)紫外分光光度法測定, 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式為y=0.0073x-0.0189(R2=0.9991)。經(jīng)檢測，無患子皂苷提取液吸光度OD=0.2147。經(jīng)計算，無患子提取液中皂苷含量為160 mg/mL。

3.2 無患子對小鼠耳腫脹程度的影響

小鼠的耳腫脹程度通過兩耳之間的厚度差來表示，試驗結(jié)果見表1。與空白對照組相比較，模型對照組的雙耳厚度差顯著升高(P<0.01)，說明TPA致小鼠耳腫脹模型造模成功；與模型對照組相比較，地塞米松組、低劑量組、中劑量組、高劑量組雙耳厚度差均顯著下降(P<0.01)，且三個劑量組呈線性下降，三個劑量組的下降幅度均小于陽性對照組。

表1 各組小鼠耳厚度測定結(jié)果

3.3 耳組織病理結(jié)果

與空白對照組相比較，模型對照組組織局部固有層可見輕中度水腫，結(jié)構(gòu)疏松；局部固有層可見少量中性粒細(xì)胞浸潤，少量皮質(zhì)腺可見炎性細(xì)胞浸潤。低劑量組組織局部固有層可見輕度水腫，結(jié)構(gòu)疏松；固有層可見中性粒細(xì)胞散在浸潤；局部可見肥大細(xì)胞散在浸潤。中劑量組組織局部固有層可見輕度水腫，結(jié)構(gòu)疏松；固有層可見中性粒細(xì)胞散在浸潤，高劑量組組織無明顯炎性細(xì)胞浸潤；表皮、固有層形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。

圖1 各組小鼠耳組織病理切片結(jié)果

3.4 耳組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量

各組實驗動物耳組織中TNF-α、IL-6、IL-1β測定結(jié)果見表2。試驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組 TNF-α、IL-6、IL-1β的含量明顯升高；陽性對照藥地塞米松可以顯著降低TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌，無患子皂苷各劑量組均可以顯著降低TNF-α分泌(P<0.01)，中劑量組和高劑量組可以降低耳組織中IL-6的含量(P<0.05)；三個劑量組對炎癥因子IL-1β無明顯作用。

表2 各組小鼠耳組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

3.5 無患子皂苷抑菌結(jié)果

由表3可知，無患子皂苷對除黑曲霉外的8種菌有較好的抑菌能力，在較低濃度下就可以抑制菌種生長。其中對須癬毛癬菌的抑菌能力最好，在濃度為0.005 mg/mL即可抑制該菌生長；其次為白色念珠菌，在1.25 mg/mL濃度時可抑制其生長；對黑曲霉的抑菌效果最差，需要在80 mg/mL時才有抑菌效果。

表3 無患子皂苷對供試菌的MIC值

4 討論

炎癥是機體對損傷因子所產(chǎn)生的正常防御反應(yīng)，適度的炎癥反應(yīng)對人體是有益的，但嚴(yán)重的炎癥則會導(dǎo)致自身損傷。在炎癥中會產(chǎn)生各種促炎和抗炎中間體，炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β都在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色[14]。佛波酯(TPA)是巴豆油的主要活性成分，能夠誘導(dǎo)小鼠耳組織角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥細(xì)胞因子[15]，其模型比較穩(wěn)定，可廣泛用于化合物或植物活性成分的抗炎活性評價。有研究表明，無患子皂苷對二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠致小鼠足腫脹模型中具有抗炎活性[16]。在本研究中，我們選擇了TPA致小鼠耳腫脹模型對無患子皂苷的抗炎活性進(jìn)行研究，并初步考察了其作用機制。試驗結(jié)果顯示，陽性對照地塞米松和無患子皂苷進(jìn)行局部治療均顯著降低了TPA引起的耳腫脹(P<0.01)，并降低了組織細(xì)胞中的炎性細(xì)胞浸潤，表明無患子皂苷具有較好的抗炎作用。

TNF-α、IL-6 被認(rèn)為是最重要的促炎細(xì)胞因子，其中TNF-α出現(xiàn)在炎癥反應(yīng)的最早階段，能夠激活中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其他多種炎癥因子包括 IL-6的釋放[17]；TNF-α還是與炎癥嚴(yán)重程度有關(guān)的分子，也作為評價藥物治療作用高低的重要指標(biāo)[18]；IL-6 能活化絲裂原活化蛋白激酶，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄激活因子促進(jìn)炎癥進(jìn)程。IL-1β能促進(jìn)免疫應(yīng)答，參與炎癥反應(yīng)，增強NK細(xì)胞的殺傷力，刺激單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IL-6等細(xì)胞因子[19]。在本試驗中，無患子皂苷各劑量組均可以顯著降低TNF-α分泌水平(P<0.01)，中劑量組和高劑量組可以降低耳組織中IL-6的含量(P<0.05)，但是無患子對炎癥因子IL-1β無降低作用。綜上，無患子皂苷具有抗炎作用，其機制可能與改善炎癥細(xì)胞浸潤與抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)有關(guān)，可以一定程度地抑制炎癥引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)，從而緩解炎癥反應(yīng)發(fā)生的程度，進(jìn)而防止進(jìn)一步的組織損傷。

人們的居住環(huán)境中，室內(nèi)空氣、墻面、廚房、餐具等均有微生物分布，空氣中的細(xì)菌和真菌種類則有數(shù)十至數(shù)百種之多[20]，致病菌可引起人體出現(xiàn)過敏性皮炎、過敏性肺炎、腹瀉等危害人體健康的疾病。我們在試驗中選擇了家居環(huán)境中具有代表性的菌種，黑曲霉、枝孢菌為引起室內(nèi)物品霉變和墻面發(fā)霉的常見霉菌；大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌為餐具、案板易污染的細(xì)菌菌種，容易引起嘔吐、腹瀉、急性腸胃炎等消化系統(tǒng)疾病；肺炎克雷伯菌和溶血鏈球菌是室內(nèi)空氣中常見的細(xì)菌，在人體免疫力低下的情況下會侵入人體引起相關(guān)疾??；白色念珠菌和須癬毛癬菌是人體皮膚表面分布的兩種常見致病真菌。試驗結(jié)果表明，無患子皂苷對除黑曲霉外的8種環(huán)境有害菌具有抑菌能力，其中對須癬毛癬菌效果最好，MIC為0.005 mg/mL，其他7種菌MIC在1.25～10 mg/mL之間。因此，無患子皂苷對有害菌具有較好的抑菌活性，且為植物來源成分，對皮膚刺激小，安全可靠，可作為天然抑菌劑使用。