產酯酵母及其產酯關鍵酶的研究進展

彭立影，劉功良*，費永濤，余潔瑜，劉銳，白衛(wèi)東，王莉嫦，賈愛娟

1(仲愷農業(yè)工程學院 輕工食品學院， 廣東 廣州，510225)2(廣州鷹金錢食品集團有限公司，廣東 廣州，510655) 3(廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東 中山，528437)

產酯酵母是一類可產酯類物質的酵母菌。產酯酵母大多屬于漢遜酵母(Hansenula)，少數屬于球擬酵母屬(Torulopsis)，具有較強的氧化特性和產酯能力。產酯酵母在發(fā)酵過程中產生醇類、酯類、酸類、烷烴類、芳香烴類、酮類等，這些物質含量各異，構成了不同酵母菌的獨特發(fā)酵香氣，已應用于白酒、葡萄酒及調味品等食品發(fā)酵行業(yè)中。

近年來，國內外對產酯酵母酯類物質的合成研究逐漸成為發(fā)酵食品行業(yè)的重要領域，產酯的關鍵基因和關鍵酶不斷被深入挖掘。深入研究產酯酵母的產酯機制，能更好提高產品的品質，豐富產品口味。本文對國內外產酯酵母篩選及其產酯合成關鍵酶進行綜述，以期為食品發(fā)酵行業(yè)發(fā)酵菌株的選擇及合成酯類化合物提供一定的理論依據。

1 產酯酵母的種類

產酯酵母對發(fā)酵產品的風味具有重要作用，可改善風味、提質增香。目前，國內外已報道的高產酯酵母菌有魯氏接合酵母(Zygosaccharomyesrouxii)、異常畢赤酵母(Pichiaanomala)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)等。

1.1 畢赤酵母屬

畢赤酵母屬(Pichia)又為漢遜酵母屬(Hansenula)。畢赤酵母是一類需氧性酵母，其細胞呈圓形或橢球形，多邊芽殖，每個子囊含有1～4個表面光滑的子囊孢子。畢赤酵母在有氧條件下，可利用葡萄糖等碳源高密度發(fā)酵，在白酒、葡萄酒中均有發(fā)現(xiàn)該類酵母可產酯類物質，提高產品質量。于洋等[1]將霞多麗葡萄中分離得到的發(fā)酵畢赤酵母(P.fermentans)YF-19進行純種發(fā)酵，采用氣相色譜測定揮發(fā)性物質，發(fā)現(xiàn)該酵母產乙酸苯乙酯的能力最強。SYLVESTER等[2]篩選出17種非釀酒酵母并將其應用于啤酒發(fā)酵第1階段產生風味酯和酚類化合物，發(fā)現(xiàn)畢赤酵母(P.kluyverii)可增加乙酸異戊酯(水果味、香蕉味)，且所有的畢赤酵母屬菌株可產生高濃度的乙酸乙酯。ZHANG等[3]從大曲中篩選出1株畢赤酵母(P.manshurica)，并將其運用于醋中發(fā)酵，顯著提高酸和酯的產量，使其具有濃郁的果味和濃郁的奶油和堅果味，從而提高醋的品質。陳嘉等[4]從傳統(tǒng)山西老陳醋中分離出1株畢赤酵母(P.scaptomyzae)，該菌株產乙酯類物質含量高，且低產高級醇。畢赤酵母與釀酒酵母在白酒釀造中進行混合發(fā)酵，可顯著增加乙酸乙酯的含量，改善白酒的風味物質含量。這些研究結果可說明，將畢赤酵母運用于酒類發(fā)酵中可增加酒體中的酯類物質，豐富產品風味。

1.2 假絲酵母屬

假絲酵母屬(Candida)是一類通過出芽繁殖，可形成假菌絲、不產子囊孢子的酵母菌，其細胞形態(tài)呈球形、橢圓形、長條形等。假絲酵母發(fā)酵能力弱、可直接同化淀粉，在白酒、米酒、醬油、果酒中產風味物質。假絲酵母中可產酯類物質的主要有間型假絲酵母(C.intermedia)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、克魯斯氏念珠菌(C.krusei)、光滑假絲酵母(C.glabrata)等。平常假絲酵母(C.inconspicua) 菌株發(fā)酵蘋果汁，可產生多種酯類物質，顯著改善蘋果汁發(fā)酵風味[5]。假絲酵母因自身可合成甘油，對高鹽環(huán)境具有很強的耐受性。在醬油發(fā)酵后期，加入假絲酵母可顯著提高醬油中揮發(fā)性風味物質如酯類、醇類等。馮杰[6]研究了耐高鹽增香酵母——埃切假絲酵母(C.etchellsii)CICIM Y0600的代謝特性，系統(tǒng)性分析了其在醬油中的增香作用，發(fā)現(xiàn)該菌株的添加可提高醬油中的4-乙基愈創(chuàng)木酚和HEMF等典型風味物質。

1.3 其他酵母菌

產香酵母的類群多，目前在發(fā)酵行業(yè)中已有應用的有數十種。醬油發(fā)酵中，其產香酵母主要為魯氏接合酵母(Z.rouxii)和球擬酵母(Torulopsis)，具有優(yōu)良的耐鹽性能，對醬油特殊風味的形成具有重要的作用。球擬酵母屬在醬香型白酒中已被廣泛應用，且該類酵母的酯分解能力低，有利于酯類物質的合成?？勰覐湍そ湍?S.fibuligera)和多株伯頓絲孢畢赤酵母(Hyphopichiaburtonii)在醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵中可產大量的酯類和醇類等[7]。產酯酵母在酒類行業(yè)的應用，可以增酯降醇，提升酒的質量。酵母在發(fā)酵過程中，可通過代謝和自溶，參與風味物質的生成，豐富了酒體的香氣，如有孢漢遜酵母(H.uvarum)、魯氏接合酵母(Z.rouxii)等。葡萄中存在不同種類的產酯酵母，如耐熱克魯維氏酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、漢遜酵母(H.guilliermondii、H.evarum)、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)等。由以上研究可知，產酯酵母對發(fā)酵食品的香氣成分具有巨大的貢獻。產酯酵母種類增加，可改善發(fā)酵食品的風味。

2 產酯酵母的選育

2.1 產酯酵母產酯能力的檢測

產酯酵母所產酯類物質的種類較多，在初篩或選育過程中，通常以總酯含量為檢測指標。篩選產酯酵母總酯測定中，指示劑法有皂化中和法、靜置皂化法和微波皂化法。陸振群[8]利用皂化中和法測定發(fā)酵的豆芽汁培養(yǎng)基中總酯含量，從酒曲中篩選出1株高產酯酵母S8。待測溶液的顏色及渾濁程度對常規(guī)方法終點的判斷具有較大的干擾，電位滴定法是通過電位pH值確定滴定終點，可避免此缺點。楊盛春等[9]采用自動電位滴定法測定3類6種酒中總酸與總酯的含量，對比國標法測定結果吻合度較好。該方法不僅操作簡便，且精密度和準確度較好。

在分析測定還原糖類較高的酒類總酯含量中，還原糖對總酯的測定具有較強的干擾。在堿性條件和水浴加熱下，葡萄糖會發(fā)生歧化、羥醛縮合等反應生成葡萄糖酸等羧基化合物，消耗一定的NaOH，從而影響總酯的測定[10]。同時，葡萄糖在強堿性條件下形成雙鍵，在不同位置的烯醇式雙鍵與碳鏈斷裂分解為醛，醛聚合生成樹脂狀物質(羥醛縮合反應)使溶液變黃，從而影響指示終點的判斷。微波皂化法在白酒和陳醋總酯測定中的應用已有相關報道。在微波作用下，發(fā)酵液中的酯類物質與堿的皂化反應在溫度較低(<65 ℃)的條件下也可進行。微波的快速熱效應可加快皂化反應，高效測定總酯含量。

指示劑法測定總酯較為繁瑣，在檢測大批樣品時，需耗費大量的時間和水電資源用于回流。氣相色譜法可減少工作量，降低能耗，但其定量酯需要各種標樣定量。劉千等[11]采用氣相色譜法測定229份原酒中4種主要乙酯含量的同時，計算樣品中總酯含量。結果表明，對比GB/T 10345—2007標準測定方法，測定的總酯含量無明顯差異；該方法具有快速、準確的優(yōu)點。

表1 總酯測定方法優(yōu)缺點Table 1 The advantages and disadvantages of total ester determination method

2.2 自然選育

從酒曲、酒醪、醬油、豆瓣醬等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中可篩選產酯效果好的野生型菌株。從自然界微生物中篩選理想菌種的主要步驟為采集菌樣→富集培養(yǎng)→純種分離→性能鑒定。羅小葉等[17]通過可培養(yǎng)方法從醬香大曲中分離出1株主產果香味的酵母菌株，對其進行菌種鑒定生理生化特性分析，確定該菌株為扣囊復膜酵母(S.fibuligera)。ZHANG等[3]用孟加拉紅培養(yǎng)基從大曲固態(tài)發(fā)酵酒醅中分離出19株酵母菌，通過產酯發(fā)酵培養(yǎng)基篩選出1株高產酯酵母菌株Y14，鑒定為盔狀畢赤酵母(P.galeiformis)。以Y14強化大曲為發(fā)酵劑，在實驗室規(guī)模發(fā)酵的蒸餾酒及醋具有濃郁的香氣及悠長的口感。由于酯類物質極不穩(wěn)定，蒸發(fā)快，GARAVAGLIA等[18]提出了一種簡便、高效、快速的頂空-固相萃取法直接從萃取瓶中快速篩選產酯酵母。由于自然突變頻率低，僅靠自然選育對于篩選優(yōu)勢菌種具有很大的局限性，這限制了產酯酵母的來源和使用。

2.3 誘變育種

誘變育種是微生物育種的主要方法之一，也是選育大多數優(yōu)良高產菌株的首選方法。李銳利[19]采用原生質體紫外、化學、復合及再生誘變育種手段，對酒曲中分離篩選出的高產乙酸乙酯酵母菌株進行改造，提高了其產酯性能和耐溫性能。陸振群[8]采用紫外照射，對酒曲中篩選得到的1株高產酯酵母S8，通過杜氏發(fā)酵管產CO2體積及發(fā)酵總酯測定篩選得1株優(yōu)良菌株Y16，其發(fā)酵產總酯量可達3.21 g/L，誘變后產酯總量提高了75.28%。王春玲等[20]采用紫外及甲基磺酸乙酯誘變和原生質體融合篩選出1株耐鹽性(質量濃度>180 g/L)釀酒酵母，有效提高了乙酸乙酯、乙醇、乳酸乙酯等風味物質的含量。盡管誘變育種可提高基因突變頻率，但長期使用誘變劑處理菌株，會使菌株產生“疲勞效應”，同時影響菌種的生長代謝，不利于食品的發(fā)酵。

2.4 原生質體融合育種

原生質體融合是將遺傳性狀不同的2個細胞的原生質體進行融合, 以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程。采用原生質體融合技術將性狀優(yōu)良的菌種進行融合，從而獲得性狀更好的菌株，是選育優(yōu)良菌種的新途徑。YE等[21]以蘋果酒中分離出的克魯斯氏念珠菌(C.krusei)PF14和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)WF1為親本菌株，通過超聲波處理制備原生質體，紫外滅活法和熱滅活法使原生質體失活，利用原生質體電融合構建了新的酵母雜交菌株R4，該菌株可用于發(fā)酵蘋果汁，改善蘋果酒的香氣及風味多樣性。林小江等[22]將低產甲醇釀酒酵母(S.cerevisiae)滅活的雙親單倍體原生質體與生香酵母進行融合，得到1株低甲醇與高產酯的釀酒酵母融合菌株。原生質體融合雖可突破種屬限制，但所獲得的融合子的遺傳穩(wěn)定性較差，常發(fā)生分離回復的現(xiàn)象，導致性能退化，并且原生質體融合后DNA交換和重組隨機發(fā)生，缺乏遺傳標記，增加了重組體分離篩選難度。

2.5 基因工程育種

隨著現(xiàn)代分子生物技術的發(fā)展，利用基因工程選育具有優(yōu)良性狀的菌株已取得較大的進展。過表達產酯基因及敲除水解酶基因，可提高酯的生成。葛峻伶等[23]發(fā)現(xiàn)，敲除BAT2基因的同時過表達Lg-ATF1基因的重組菌株S5-Lg與親本菌株相比，乙酸乙酯生成量提高了26.81%，同時，異丁醇和異戊醇皆下降近10%。CRISPR-Cas系統(tǒng)是操作細菌、酵母和人類細胞基因組簡單高效方法的基礎。L?BS等[24]通過設計RNA聚合酶Ⅲ雜合啟動子，將釀膿鏈球(Streptococcuspyogenes)中的CRISPR-Cas9系統(tǒng)應用于馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)，影響酵母菌細胞中乙酸乙酯和乙醇的合成。CRISPR-Cas9是一種RNA引導的DNA核酸內切酶，它利用RNA-DNA堿基配對來靶向外源目標基因。然而，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的主要局限在于脫靶效應。為解決該問題，LI等[25]采用核酸內切酶I-SCEI的表達，建立了一個快速高效的系統(tǒng)，加快了白酒釀酒酵母無縫缺失的進度和效率。該研究在TEF1啟動子控制下過表達PTEF1-ATF1-TPGK1基因片段中的ATF1基因，并將該片段插入氨基酸轉氨酶中BAT2基因缺失的菌株中，構建BAT2基因缺失、ATF1基因過表達酵母菌Hα5。通過與親本菌株比較，菌株Hα5乙酸乙酯濃度高出34.84倍。基因工程育種技術操作方法復雜，設備昂貴，且外源基因的安全性一直備受爭議，但基因工程育種存在多方面的優(yōu)勢，如定向性明確，遺傳穩(wěn)定，基因工程改造可為選育產酯優(yōu)良的酵母和改善發(fā)酵食品風味提供一定思路和參考。

3 酵母菌產酯的關鍵酶

酯類物質合成主要通過3個途徑，包括酯化反應途徑、醇?；D移酶途徑和醇脫氫酶途徑。非釀酒酵母可生成多種醇類、醛類和酯類等香味物質。深入研究產酯酵母的產酯關鍵酶，有助于更好地闡述產酯酵母機制并促使其應用。目前，普遍認為是酵母菌在發(fā)酵過程中利用葡萄糖，經糖酵解(embden-meyerhof-parnas-pathway，EMP)途徑代謝生成乙醇和乙酸，而后在酯酶的作用下生成乙酸乙酯。酵母胞內酶和胞外酶都具有酯化能力，且在酯化過程中，酵母可以通過酯酶的逆反應生成酯類物質。酒類中的酯類物質主要分為兩大類，一類是乙酸酯，主要由醇乙?；D移酶(alcohol-O-acetyltransferase)催化底物乙酰輔酶A和乙醇生成；一類是脂肪酸乙酯，主要由醇?；D移酶催化相應的?；o酶A和乙醇合成。在白酒釀造微生物中，乙酸乙酯的生成主要由底物乙酰輔酶A(acetyl coenzyme A，acetyl-CoA)、乙醇濃度和醇乙?；D移酶活性決定。酯類物質合成途徑如圖1所示。

圖1 酯生成途徑Fig.1 The formation pathway of esters

3.1 乙酰輔酶A

釀酒酵母細胞中，乙酰輔酶A是含量最豐富的?；o酶A，分布于細胞核、細胞質、線粒體、過氧化物酶體等不同的亞細胞區(qū)域。丙酮酸代謝支路(pyruvate dehydrogenase,PDH旁路途經)是乙酰輔酶A主要形成途徑，其次在線粒體中經丙酮酸脫氫酶途徑形成，少部分由ATP直接激活乙酸經轉?；感纬?。在PDH旁路途徑中，乙酰輔酶A合成酶(acetyl coenzyme A synthetase，ACS)是合成乙酰輔酶A的關鍵酶，由基因ACS1和ACS2編碼。ACS1對酵母細胞中以非葡萄糖為碳源的代謝具有重要作用，缺氧和高濃度葡萄糖可抑制其表達；ACS2是釀酒酵母利用葡萄糖為碳源進行生長和繁殖所必需的基因[26]。釀酒酵母細胞中，過表達ACS1和ACS2可提高乙酰輔酶A含量。

有學者發(fā)現(xiàn)，泛酸激酶(pantothenate kinase，panK)中的pank基因也可促進酯類物質的生成。泛酸激酶是輔酶A生物合成途徑中的關鍵調節(jié)酶，同時補充輔酶A前體泛酸，使得細胞內輔酶A和乙酰輔酶A水平升高。VADALI等[27]在此基礎上，研究發(fā)現(xiàn)同時過表達ATF2基因和pank基因比僅過表達ATF2基因的菌株產乙酸異戊酯含量多6倍。CAB2基因編碼磷酸泛酸半胱氨酸連接酶。在泛酸到輔酶A的代謝途徑中，CAB2基因的表達可影響輔酶A的合成。DONG等[28]構建工程菌株，過表達基因CAB2、ACS2和ATF1，最后乙酸乙酯含量均有所提高。

乙酰輔酶A水解酶(acetyl coenzyme ahydrolase，ACH)由ACH1基因編碼，參與細胞內acetyl-CoA的調節(jié)，催化acetyl-CoA水解為乙酸和HSCoA。鄭楠等[29]通過敲除ACH1基因降低acetyl-CoA的降解，過表達ACS1和ACS2基因得到工程菌株乙酸乙酯的生成量分別比親本菌株提高26.12%和23.70%。有研究報道，乙酰輔酶A水解酶在葡萄糖的環(huán)境下受到抑制。PLATA等[30]研究了葡萄糖和氧對釀酒酵母酒精發(fā)酵生產乙酸乙酯和乙酸異戊酯的影響，同時測定乙醇乙酰轉移酶和酯酶在體外的活性，發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度只影響AATase的最大活性，而氧對AATase的最大活性有輕微的抑制作用；酯酶僅在低或中等葡萄糖質量濃度(50或100 g/L)下催化乙酸乙酯的合成，并在固定生長期對乙酸異戊酯達到最大水解活性，在葡萄糖質量濃度為250 g/L和半厭氧條件下，培養(yǎng)基中乙酸乙酯和乙酸異戊酯的質量濃度最高。

乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)系統(tǒng)對脂肪酸乙酯的合成具有重要作用[31]。乙酰輔酶A羧化酶可將乙酰輔酶A轉化為丙二酸單酰輔酶A，脂肪酸合成酶復合體將乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A轉化為脂肪?；o酶。同時，乙酰輔酶A羧化酶是脂肪酸生物合成中的關鍵酶及限速酶，脂肪?；o酶可轉化為游離脂肪酸。研究表明，脂肪酸合成基因如ACC1、FAS1和FAS2在轉錄水平受肌醇介導的負調控基因OPI1所抑制。CHEN等[32]利用釀酒酵母代替霉菌、細菌和產香酵母來提高己酸乙酯的產量，過表達ACC1、FAS1和FAS2基因的同時缺失OPI1基因，構建了3株重組菌株α5-ACC1ΔOPI1、α5-FAS1ΔOPI1和α5-FAS2ΔOPI1，發(fā)現(xiàn)重組菌株在濃香型白酒中能顯著提高己酸乙酯的產量，且重組菌株α5-FAS1ΔOPI1也能提高乙酰輔酶A的含量。

3.2 醇?；D移酶

醇?；D移酶(alcohol acyltransferase，AAT)的活性是酯類合成的決定性關鍵因素。醇乙?；D移酶主要由基因ATF1、ATF2和Lg-ATF1編碼，催化酵母中乙酰輔酶A和乙醇結合，生成乙酸酯。在acetyl-CoA含量增加的基礎上，增強醇乙酰基轉移酶的活性，可促進乙酸乙酯的生成。研究表明，過表達ATF1基因可顯著提高乙酸乙酯的含量，且Lg-ATF1基因的作用弱于ATF1基因[33]。VERSTREPEN等[34]將實驗室菌株及商業(yè)釀造菌株中敲除或過表達ATF1、Lg-ATF1和ATF2，通過頂空色譜和氣相色譜-質譜聯(lián)用技術對酯的形成進行監(jiān)測，結果表明，ATF1和ATF2的表達水平對乙酸乙酯和乙酸異戊酯的形成有較大影響。基因ATF1和ATF2的表達可生成低揮發(fā)性酯如乙酸酯類，且基因ATF1和ATF2可調控其他醇?；D移酶活性。同時缺失ATF1和ATF2基因的菌株不形成乙酸異戊酯，表明編碼醇乙酰基轉移酶的ATF1和ATF2基因共同調控酵母細胞內異戊醇轉移酶的活性。ATF1的活性還受蛋白激酶Sch9p和蛋白激酶A(protein kinase，PKA)的調控，參與應激反應和營養(yǎng)傳感信號通路[35-36]。

氨基酸是發(fā)酵中的重要原料。酵母中高級醇的生物合成是由支鏈氨基酸(branched-china amino acid,BCAA)代謝途徑中用于降解氨基酸的α-酮酸中間體合成。酵母中的BCAAs通過Ehrlich途徑的轉氨作用轉化為α-酮酸。支鏈氨基酸分解代謝的第一步和限速步驟分別由BAT1和BAT2編碼的線粒體和胞質支鏈氨基酸轉氨酶催化。BAT2缺失對高級醇的形成有顯著影響。LI等[37]揭示了醇乙?；D移酶基因(Lg-ATF1、ATF2、ATF1)過表達與BAT2缺失的相互關系，發(fā)現(xiàn)過表達ATF2且缺失BAT2的菌株可以顯著增加酯的生成和降低酒精濃度，過表達ATF1且缺失BAT2的菌株能更大程度上進一步提高酯醇比，而Lg-ATF1過表達對酯和高級醇的生成沒有影響。

釀酒酵母中的EHT1和EEB1基因也可編碼醇酰基轉移酶，是合成中鏈脂肪酸乙酯的關鍵基因。李鋒等[38]對釀酒酵母醇己?；D移酶基因EHT1進行了過表達，發(fā)現(xiàn)過表達EHT1基因能提高釀酒酵母產酯性能，特別是對產己酸乙酯有顯著作用。KRUIS等[39]在酵母中發(fā)現(xiàn)一個新的醇乙?；D移酶家族Eat1，該酶在所有產乙酸乙酯的酵母中都存在編碼基因序列，確定了Eat1是酵母合成乙酸乙酯的關鍵酶。在K.marxianus中，酯的合成可能是由乙醇與乙酰輔酶A通過ATF1活性縮合，也可能通過EAT活性縮合[23,40]。L?BS等[41]研究EAT1作為酯生物合成的主要生化途徑，并創(chuàng)建了一系列具有酯生物合成假定活性的基因敲除來確定和控制細胞內的定位，發(fā)現(xiàn)敲除EAT1的菌株其乙酸乙酯的生物合成幾乎被消除，且乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯的合成量減少了88%。SAERENS等[42]評估了EHT1和EEB1基因編碼的醇酰基轉移酶在體外的性能，發(fā)現(xiàn)對脂肪酸乙酯的合成及水解都具有酶活性。但通過構建過表達EHT1和EEB1基因菌株，發(fā)現(xiàn)脂肪酸乙酯的合成并未顯著增加。SAERENS等[43]再次研究，發(fā)現(xiàn)乙酯水平的變化不能用EEB1表達水平的差異進行解釋，并且中鏈脂肪酸乙酯合成的主要限制因素并不是合成酶的活性，而是脂肪酸前體的含量。

3.3 醇脫氫酶

醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)是一類含鋅或含鐵的醇脫氫酶，可將醛或酮還原為醇，氧化半縮醛化合物，催化生物體內醇代謝。半縮醛是由醇和醛混合物形成的，在半縮醛羥基被氧化后，形成酯，該反應以NAD(P)+為氫受體。釀酒酵母ADH具有多種半縮醛脫氫酶活性，用于合成甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯和乙酸乙酯。ADH產生酯的機理基于半縮醛與仲醇的結構相似性，對體內酯的產生具有重要作用。在釀酒酵母中編碼ADH的基因是adh1-adh7，ADH特異性決定了某些(高級)醇可用于酯的形成。因此，ADH可能對酵母的產酯有間接且顯著的影響。

早有研究表明[44]，染色體中缺失基因ADH1、ADH2與缺失基因ADH1的釀酒酵母對比，前者酵母的乙酸乙酯生成量顯著降低，但敲除ADH2的菌株產生乙酸乙酯的積累量沒有變化。可見，基因ADH1可影響釀酒酵母中乙酸乙酯的合成。劉港等[45]用植物乳桿菌的乳酸脫氫酶基因ldhL1替換釀酒酵母丙酮酸脫羧酶基因PDC1構建L-乳酸酵母菌株，顯著提高了乳酸乙酯的產量。YURIMOTO等[46]從波氏假絲酵母菌中克隆得到醇脫氫酶，由CbADH1、CbAdh2、CbAdh3基因編碼，并通過基因干擾實驗表明波氏假絲酵母菌中甲酸甲酯的合成由胞質基因ADH1控制。VANRIJSWIJCK等[47]研究Cyberlindenerafabianii65、P.kudriavzevii129和S.cerevisiae131體外醇脫氫酶和醇乙酰轉移酶的活性，發(fā)現(xiàn)它們與酯的形成沒有相關性。相比之下，這3種酵母的乙酸酯水解酶活性與乙酸酯產量呈明顯的負相關。如何在酯的合成和水解中達到平衡，使得酯的凈積累量達到需要的目標，是下一步研究的重點方向。

3.4 水解酶

酯在合成的過程中發(fā)生酯的水解。早有研究發(fā)現(xiàn)，由IAH1編碼的酶負責酯的水解。ATF1過表達和IAH1斷裂突變菌株可顯著提高黃酒中乙酸酯的含量，降低異戊醇的含量[48]。SCHNEIDERBANGER等[49]對德國小麥啤酒生產中最常用的5種小麥啤酒酵母菌株的乙酸酯生產能力進行測定，探討小麥啤酒酵母在一次發(fā)酵過程中的基因表達，發(fā)現(xiàn)基因ATF1、ATF2和IAH1在初級發(fā)酵期間4 d內的表達水平與乙酸酯的形成緊密相關。大多數酵母菌株在24～48 h 出現(xiàn)了ATF1的表達，酯的產量也在增加。在同一時期，乙酸異戊酯和乙酸乙酯合成的同時也發(fā)生降解，IAH1的表達也在增加。IAH1在N-末端附近具有明顯的GDSL序列模體和4個保守的序列塊，這是SGNH水解酶的一個特征，SGNH水解酶是水解酶/脂解酶的一個亞家族。IAH1的晶體結構在其催化三聯(lián)體中有一個Ser12/Asp187/His190序列和2個殘基，即Gly53和Asn83，它們充當穩(wěn)定反應中間體的氧陰離子孔。Ser12位于b1末端的拓撲開關點，是親核分子和氧陰離子空穴的第3個質子供體。His190作為一個堿基，通過去質子化羥基使活性位點Ser12更親核。這一結構特征符合SGNH水解酶的親核/酸/His規(guī)律。MA等[50]確定了由IAH1基因編碼的酶的晶體結構，發(fā)現(xiàn)在底物結合區(qū)有一個額外的C-末端參與了同二聚體的形成，這種額外的C-末端限制了活性位點的進入，并且在確定底物特異性方面起著重要作用。可見，C-末端的缺失提供了更好的途徑進入酶的活性位點，使得它能夠容納更長的?；?。

4 結論與展望

非釀酒酵母主要產香、產酯等香味物質，對于改善白酒、啤酒、醬油等發(fā)酵食品的風味具有重要作用。酵母本身理化性質存在一定差異，在不同的環(huán)境中會呈現(xiàn)不同的特點，可篩選出具有特殊能力的產香酵母，應用于發(fā)酵食品、調味品等領域中。研究酵母菌的產酯過程及關鍵酶可為菌株選育及發(fā)酵食品風味的改善提供借鑒依據。在后續(xù)的研究工作中，一方面可進一步探究編碼酯類合成關鍵酶的其他基因。另一方面，可將酯類物質合成中編碼關鍵酶的基因整合到其他菌株基因組中，構建新的發(fā)酵菌株，從而提高酯類物質的含量。多項研究表明乙酸酯的合成很大程度取決于ATF1和ATF2的表達，影響其表達的細胞因子都是調節(jié)乙酸酯合成的潛在靶點。同時，國內外對酯類物質的研究主要在于酯合成上，而在最終發(fā)酵產物中，對于酯水解的研究較少，如何在酯合成和水解之間找到平衡點，也是潛在的研究方向。