生食大眼金槍魚中生物胺產(chǎn)生菌的分離與鑒定

李少麗，鄧建朝，李春生，楊賢慶，吳燕燕，陳勝軍，馬海霞

1(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州，510300) 2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

大眼金槍魚(Thunnusobesus) 又稱肥壯金槍魚，屬鱸形目鯖科，大洋性洄游魚類，分布于印度洋、大西洋、太平洋和南海外海等地[1]。其肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，不僅富含蛋白質，還含有DHA和EPA等不飽和脂肪酸，食用和商用價值極高[2-4]。據(jù)最新國際漁業(yè)動態(tài)報道，隨著金槍魚市場價格不斷走高，捕撈量也在大幅提高[5]。

目前，國內(nèi)市售大眼金槍魚占有市場比例較高，由于其屬于紅肉魚類，在加工和流通過程當中，如果加工和貯藏不當，容易造成生物胺超標。生物胺是一種低分子量的堿性含氮化合物，廣泛存在于蛋白質及氨基酸含量豐富的水產(chǎn)品中，主要通過微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶分解游離氨基酸產(chǎn)生[6-8]。食用生物胺超標水產(chǎn)品，易引起人體中毒，近些年來因食用金槍魚而發(fā)生的生物胺中毒事件時有發(fā)生。國內(nèi)對于生食金槍魚已經(jīng)有了相關標準，其中組胺不得超過90 mg/kg[9-11]。

國內(nèi)外對水產(chǎn)品中生物胺產(chǎn)生菌已經(jīng)有了相關研究，常見的有弧菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、乳酸菌、腸桿菌等[12-13]，除此之外一些新的菌群也被證實可產(chǎn)生生物胺，如沙門菌群、巴斯德菌和根瘤菌等不同菌科[14]。目前，大眼金槍魚中生物胺產(chǎn)生菌的相關研究鮮有報道。本文將大眼金槍魚的生魚片作為研究對象，通過微生物分離結合高效液相色譜技術，篩選出了生物胺產(chǎn)生菌，再利用表型特征鑒定和基因型鑒定相結合的方法[15-16]，確定了菌株的種類，以期為生食大眼金槍魚肉中生物胺的控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大眼金槍魚，購于廣州市沛洋食品有限公司(-60 ℃凍藏)。

腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、苯乙胺、組胺、酪胺、丹磺酰氯(純度≥98%)，美國Sigma公司；NaCl、NaOH、NaHCO3、NH3·H2O，廣州粵升化學試劑廠；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、L-組氨酸、色氨酸、酪氨酸、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptose soya agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptic soy broth，TSB)，廣州市普博儀器有限公司；乙睛(色譜純)，上海安譜實驗科技股份有限公司；超純水，實驗室自制。

1.2 儀器與設備

LC-20AD高效液相色譜儀，日本島津SHINADZU公司；CX41顯微鏡，日本OLYMPUS公司；MILLI-Q超純水機，美國Millipore公司；3K30高速冷凍離心機，德國 SIGMA公司；SPX-500智能生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；TU-1990紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；VITEK 2 COMPACT細菌鑒定及藥敏測試儀，法國梅里埃公司；DYY-7B電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

將金槍魚在無菌環(huán)境下解凍后置于0 ℃下貯藏備用。

1.3.2 菌落總數(shù)和K值的測定

參考GB4789.2—2016的方法[17]，測定0 ℃貯藏的大眼金槍魚中的菌落總數(shù)。

參考SC/T 3048—2014[18]的方法，測定0 ℃貯藏的大眼金槍魚中K值變化。K值計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ATP為腺苷三磷酸濃度、ADP為腺苷二磷酸濃度、AMP為腺苷酸濃度、IMP為肌苷酸濃度、HxR為次黃嘌呤核苷濃度、Hx為次黃嘌呤濃度，單位均為μmol/g。

1.3.3 培養(yǎng)基配制

參考朱曉娟[19]和郝淑賢等[20]的方法配制如下培養(yǎng)基。

生物胺篩選培養(yǎng)基(g/L)： 胰蛋白胨5.0、酵母浸粉5.0、NaCl 5.0、CaCO31.0、瓊脂20、溴甲酚紫0.06、L-組氨酸2、色氨酸2、酪氨酸2，1 mol/L HCl調(diào)pH至5.3±0.2。

TSA培養(yǎng)基(g/L)：取47 g TSA于1 L蒸餾水中滅菌，制成平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基。

TSB培養(yǎng)基：取TSB 3 g、L-組氨酸0.03 g、色氨酸0.03 g、酪氨酸0.03 g于100 mL蒸餾水中滅菌。

1.3.4 菌株的分離純化

參考吳燕燕等[21]的方法，無菌條件下取0 ℃貯藏12 d的5 g魚肉于45 mL無菌生理鹽水中，制備為10-1樣液，依次梯度稀釋到10-2、10-3、10-4和10-5后，各取100 μL菌液涂布到生物胺初篩培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d。

挑取藍紫色菌落在TSA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，30 ℃培養(yǎng)3 d。

將單菌落劃線接種于TSA斜面培養(yǎng)基上富集培養(yǎng)，并于菌種保藏箱中臨時保藏。

1.3.5 生長曲線的測定

參考AYYASH等[22]的方法，將分離純化的菌落接種于TSB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，每間隔相同時間用紫外分光光度計連續(xù)測定培養(yǎng)液的OD605nm值，觀察菌株的生長情況。

1.3.6 生物胺質量分數(shù)的測定

參考趙慶志等[23]的衍生方法略有改動，將單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)3 d，各取1 mL活化菌液離心，取上清液，對上清液進行衍生處理。

色譜條件參考GB5009.208—2016[24]的方法。色譜柱：WondaCract ODS-2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫40 ℃，流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長 254 nm。流動相A為含1%甲酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序為：0～22 min，B=58%(體積分數(shù))；22～25 min，B=78%(體積分數(shù))；25～32.01 min，B=90%(體積分數(shù))；32.01～37 min，B=58%(體積分數(shù))，外標法定量。標準曲線回歸方程如表1所示。

表1 標準曲線回歸方程Table 1 Regression equations of standard curves

1.3.7 形態(tài)學指標

觀察并記錄TSA上單菌落形態(tài)特征，挑取單菌落進行涂片、革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察并記錄其大小、顏色、形狀、排列等。

1.3.8 菌種鑒定

1.3.8.1 生理生化實驗鑒定

吸取適量的菌液分別與3 mL 0.45%(質量分數(shù)) NaCl生理鹽水混勻，配制相當于0.50～0.63麥氏單位的菌懸液，使用VITEK 2全自動微生物分析系統(tǒng)進行菌種鑒定[25]。

1.3.8.2 產(chǎn)生物胺細菌的16S rDNA 鑒定

篩選出產(chǎn)胺量最高的菌株進行DNA提取，將 PCR 擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，送與測序公司進行測序，將返回的序列進行比對。

2 結果與分析

2.1 菌落總數(shù)和K值測定結果

將大眼金槍魚生魚片置于0 ℃下貯藏，結果如圖1所示。魚肉中菌落總數(shù)的變化情況由圖1-a可知，大眼金槍魚初始菌落總數(shù)為2.46 lgCFU/g，菌落總數(shù)初期生長緩慢，第4天達到4.45 lgCFU/g，超過生食金槍魚SC/T 3117—2006規(guī)定標準[10]，第12天時菌落總數(shù)為7.13 lgCFU/g，之后菌落長勢趨于平緩。K值是反映水產(chǎn)品鮮度的一個重要指標，可以明確表明魚肉的新鮮程度。一般認為，K值低于20%為一級鮮度，20%～40%為二級鮮度，大于70%已為腐敗[26]。由圖1-b可知，魚肉初始K值為12.1%，第4天超過20%，不能用于制作生魚片[27]，K值增長速度為3.30%/d。為更加準確分離出生物胺產(chǎn)生菌，該實驗選擇菌落總數(shù)達到相對穩(wěn)定階段12 d的魚肉作為實驗樣品。

a-0 ℃下菌落總數(shù)的變化;b-0 ℃下K值的變化圖1 0 ℃下菌落總數(shù)和K值變化Fig.1 Change of colony count aerobic plate count and Kvalue at 0 ℃

2.2 生物胺產(chǎn)生菌的分離純化

典型的產(chǎn)胺菌在生物胺篩選培養(yǎng)基中顯示藍紫色，其原理是微生物利用培養(yǎng)基中的游離氨基酸生成了堿性生物胺，從而使菌落周圍環(huán)境的pH值上升，溴甲酚紫指示劑顯示為藍紫色[28]。挑取藍紫色菌落劃線接種于TSA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，最終得到9株單菌落，編號為B-1～B-9。

2.3 生物胺產(chǎn)生菌的生長曲線

將9株生物胺產(chǎn)生菌分別接種于TSB培養(yǎng)基中，確定9株細菌在0和30 ℃條件下的生長曲線，結果如圖2所示。9株菌株在0 ℃下生長緩慢，48 h后進入生長穩(wěn)定期。而在30 ℃下培養(yǎng)9株菌，對數(shù)生長期為4～12 h，之后進入生長穩(wěn)定期。結果表明，從大眼金槍魚中分離得到的9株菌株適宜在較高溫度下生長，初步鑒定為嗜溫菌(25～40 ℃)[29]。

2.4 生物胺生成情況分析

為進一步確認這9株菌的產(chǎn)胺能力，將9株菌株分別接種到TSB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3 d，分析培養(yǎng)液中生物胺產(chǎn)生質量濃度，結果如表2所示。由表2可知，9株菌均可產(chǎn)生色胺、腐胺和尸胺，菌株B-9生物胺生成能力較其他菌株最弱，總質量濃度為2.78 mg/L。B-1、B-3和B-7的產(chǎn)胺能力較強，總生物胺質量濃度分別為40.4、41.3和50.3 mg/L。其中B-1的色胺產(chǎn)生質量濃度最高，為38.9 mg/L； B-3亞精胺產(chǎn)生質量濃度最高，為31.2 mg/L；B-7酪胺產(chǎn)生質量濃度最高，為38.5 mg/L。

表2 菌株的生物胺生成情況Table 2 Biogenic amine contents produced by strains

a-9株菌株在0 ℃下的生長曲線;b-9株菌株在30 ℃下的生長曲線圖2 九株菌株在0 ℃和30 ℃下的生長曲線Fig.2 Growth curves of nine strains at 0 ℃ and 30 ℃

2.5 生物胺產(chǎn)生菌的形態(tài)特征

將3株產(chǎn)胺量最高的菌株進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。從顯微鏡下觀察到B-1為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)為乳黃色圓形凸起菌落，邊緣整齊，菌株為球狀菌，無芽孢。B-3為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)為圓形，表面光滑不透明，乳黃色，邊緣整齊，菌株為桿狀菌，無芽孢。B-7為革蘭氏陽性菌，菌落形態(tài)為白色凸起，邊緣整齊，表面光滑圓潤，菌株為球狀菌，無芽孢。

2.6 生物胺產(chǎn)生菌的鑒定

2.6.1 生理生化實驗鑒定

VITEK 2鑒菌儀是通過將檢測菌株的各項生理生化實驗反應結果與已知的菌株數(shù)據(jù)庫作比較，從而推測菌株的可能性概率，可信概率范圍為85.0%～99.0%。經(jīng)鑒定，3株菌株的生理生化實驗結果如表3所示。鑒定B-1菌株為巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)，可信概率為99.0%；B-3菌株為產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)，可信概率為97.0%；B-7菌株為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，可信概率為99.0%。

表3 菌株鑒定結果Table 3 Identification of strain

2.6.2 16S rDNA 鑒定

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物圖片結果如圖3所示，電泳可成功擴增出預期的DNA片段，且2 000 bp處擴增條帶清晰明亮，所以該PCR片段可同時作為后續(xù)PCR反應中的引物和模板，送檢測序。

圖3 三株菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of three strains

將測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，并建立系統(tǒng)進化樹，結果如圖4所示。從比對結果可知，樣本B-1與溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)親源關系最近，樣本B-3與產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)親源關系最近，樣本B-7與糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)親源關系最近。由于溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus) 為細菌致病菌，可引起一些水產(chǎn)動物大量死亡，推斷B-1來自外界環(huán)境，并隨著貯藏時間的增加，逐漸成為金槍魚腐敗菌中的優(yōu)勢菌種[30]。產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是人和動物腸道的正常菌群[31-32]，但由于金槍魚體型較大，腸道污染可能性較小，因此推斷B-3與B-7同樣來自外界環(huán)境。

圖4 基于16S rDNA 序列構建的進化樹Fig.4 Phylogenetic trees based on the 16S rDNA sequences

3 結論

本研究利用生物胺初篩培養(yǎng)基結合高效液相色譜技術，從大眼金槍魚生魚片中篩選出9株生物胺產(chǎn)生菌，其中3株產(chǎn)胺量最高的菌株分別為溶酪巨型球菌 (Macrococcuscaseolyticus)、產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)和產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)均屬于新發(fā)現(xiàn)的生物胺產(chǎn)生菌。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)曾被LADERO等[33]從乳制品中分離得到。產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)能夠引起人體食物中毒、嚴重的腸胃炎、腹瀉等疾病，對人體健康有潛在的危險性[31]。

研究表明，根據(jù)產(chǎn)胺菌的生物學特性，可通過抑制相關菌群和低溫貯藏相結合的方法來控制生物胺的生成，保證大眼金槍魚的品質和食用安全性。