代森錳鋅液相色譜法成功晉升為CIPAC方法的歷程與啟示

宋俊華， 許 梅

(1.上海沈化院科技有限公司，上海 201210； 2.利民化學(xué)有限責(zé)任公司，江蘇 新沂 221400)

由利民化學(xué)有限責(zé)任公司(以下簡(jiǎn)稱“利民化學(xué)”)自主研發(fā)的代森錳鋅液相色譜分析方法，在2019年德國(guó)布倫瑞克召開的第63屆國(guó)際農(nóng)藥分析協(xié)作委員會(huì)(CIPAC)年會(huì)上順利通過答辯，成功晉升為CIPAC方法。該方法自2016年提出申請(qǐng)，其間歷經(jīng)多次答辯，有效解決了多個(gè)技術(shù)難題，方法才得以完善。本文兩位作者分別作為方法答辯人和開發(fā)者，親身經(jīng)歷，感受良多，為此認(rèn)真進(jìn)行總結(jié)梳理，以為我國(guó)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)方法走向國(guó)際提供借鑒。

1 CIPAC方法申請(qǐng)背景

原代森錳鋅FAO標(biāo)準(zhǔn)于老程序下建立(1980頒布)，俗稱“老標(biāo)準(zhǔn)”。FAO現(xiàn)有類似“老標(biāo)準(zhǔn)”近200多個(gè)，但因其不能作為相同產(chǎn)品認(rèn)定的首家，發(fā)揮不了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)有的作用，為此2016年FAO制定了“老變新計(jì)劃”及“更新優(yōu)先列表”，代森錳鋅被列入到第一批更新名單中。作為全球第二大代森錳鋅生產(chǎn)和出口企業(yè)，利民化學(xué)在第一時(shí)間內(nèi)提交了該產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的更新申請(qǐng)，但首先遇到的難題就是有效成分分析方法問題，老標(biāo)準(zhǔn)使用的代森錳鋅分析方法(CIPAC 34/TC/M/- )為化學(xué)法，存在操作復(fù)雜，重復(fù)性差，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室不易開展，且還需使用高毒試劑等諸多缺陷。而CIPAC方法是申請(qǐng)F(tuán)AO產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的第一步，申請(qǐng)標(biāo)準(zhǔn)首先需攻克CIPAC方法這一難題。

2 成功晉升CIPAC方法的艱難歷程

常規(guī)分析方法要上升為CIPAC方法，需在全球近20家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法的小范圍及大范圍驗(yàn)證(實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證)，且驗(yàn)證結(jié)果需按照CIPAC要求的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并在CIPAC大會(huì)上匯報(bào)，在現(xiàn)場(chǎng)經(jīng)受來自全球30多個(gè)國(guó)家質(zhì)量管理實(shí)驗(yàn)室及行業(yè)實(shí)驗(yàn)室專家挑剔的目光考驗(yàn)，再由20多位國(guó)際專家組成的評(píng)審團(tuán)評(píng)審?fù)ㄟ^后才能成為CIPAC方法，適用于全球農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)管。

代森錳鋅儀器分析方法的難點(diǎn)在于其“難溶解、易分解”的特性。新方法采用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)絡(luò)合法，在堿性條件下將代森錳鋅溶解，采用液相色譜外標(biāo)法定量，與原老化學(xué)分析法相比，該方法具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、環(huán)保等諸多優(yōu)點(diǎn)。

按照CIPAC程序要求，該方法首先于2016年在國(guó)內(nèi)4家實(shí)驗(yàn)室完成了小范圍驗(yàn)證試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各項(xiàng)指標(biāo)滿意，并于同年在日本東京舉辦的第60屆CIPAC會(huì)議上進(jìn)行了匯報(bào)。隨后CIPAC同意該方法進(jìn)行下一步大范圍驗(yàn)證試驗(yàn)，并在其網(wǎng)站上公布了大范圍驗(yàn)證試驗(yàn)通知，先后有全球20多家實(shí)驗(yàn)室自愿報(bào)名參加。由于樣品國(guó)際長(zhǎng)途運(yùn)輸時(shí)間長(zhǎng)、環(huán)境不可控、部分實(shí)驗(yàn)室對(duì)代森錳鋅性質(zhì)不熟悉等多種原因，在首次大范圍驗(yàn)證試驗(yàn)中，國(guó)外多家實(shí)驗(yàn)室反映樣品不易溶解或溶解后不穩(wěn)定分解嚴(yán)重，導(dǎo)致在2017年第61屆CIPAC會(huì)議上進(jìn)行的首次大范圍驗(yàn)證結(jié)果答辯未能獲得通過。CIPAC要求對(duì)方法進(jìn)行改進(jìn)，并補(bǔ)充提交改進(jìn)后方法的方法確認(rèn)報(bào)告及溶液穩(wěn)定性報(bào)告等。

為解決上述問題，針對(duì)代森錳鋅產(chǎn)品本身的特性，利民化學(xué)改進(jìn)了分析方法，通過增加環(huán)境溫度控制(17℃)、降低柱溫(15℃)，以及使用短柱減少分析時(shí)間等多種方式來保證溶液穩(wěn)定性。改進(jìn)后的方法按照CIPAC要求完成了方法確認(rèn)報(bào)告，結(jié)果顯示方法線性、準(zhǔn)確度、精密度、回收率及溶液穩(wěn)定性等各項(xiàng)指標(biāo)合格，并于2017年通過CIPAC平臺(tái)重新組織進(jìn)行了大范圍驗(yàn)證試驗(yàn)。

但在2018年召開的第62屆CIPAC會(huì)議答辯時(shí)，該方法再次遇到了挑戰(zhàn)，因代森錳鋅化合物本身的特殊性及首次答辯時(shí)殘余的對(duì)方法的不信任感，會(huì)議代表們對(duì)方法提出了諸多質(zhì)疑，如：因方法為衍生化法，實(shí)際的分析物是什么？分析原理是什么？保留時(shí)間和紅外光譜是否足以對(duì)分析物進(jìn)行準(zhǔn)確定性？既然驗(yàn)證試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來自利民化學(xué)，那么其含量是否準(zhǔn)確，國(guó)際市場(chǎng)上是否有含量可靠的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)供應(yīng)？17℃的環(huán)境溫度對(duì)于大多數(shù)試驗(yàn)室來說，條件是否過于苛刻？最終因存疑問題過多，該方法被CIPAC評(píng)審委員會(huì)再次否決。

為解決上述問題，在查閱大量文獻(xiàn)后，經(jīng)交叉核實(shí)，確認(rèn)了方法的分析原理。

即實(shí)際分析物為乙烯雙二硫代氨基甲酸(EBDC)離子。對(duì)于方法定性不充分的問題，經(jīng)與CIPAC協(xié)商確定，定性方法除了保留時(shí)間和紅外光譜，再加上CIPAC MT 165 紫外吸收測(cè)試法，以準(zhǔn)確區(qū)分代森錳鋅和代森錳。針對(duì)17℃環(huán)境溫度控制不夠現(xiàn)實(shí)的質(zhì)疑，通過多次嘗試將環(huán)境溫度調(diào)整到20℃，并重新在此條件行進(jìn)行了溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)，直到試驗(yàn)結(jié)果顯示穩(wěn)定性數(shù)據(jù)合格為止。對(duì)液譜分析而言，定量準(zhǔn)確來源可靠的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是基石，但從Dr. Ehrenstorfer GmbH購(gòu)得的代森錳鋅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量只有70%多(代森錳鋅含量越高越不穩(wěn)定)，為了打消評(píng)委們的疑慮，利民化工將此標(biāo)準(zhǔn)品再次同時(shí)用化學(xué)法和液譜法進(jìn)行了定量，以確認(rèn)含量的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示Dr．Ehrenstorfer GmbH 70%的標(biāo)準(zhǔn)品含量可靠，可用于常規(guī)定量分析。

改進(jìn)后的方法又一次在國(guó)內(nèi)6家實(shí)驗(yàn)室和國(guó)外2家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，并在2019年第63屆CIPAC會(huì)議上再次答辯，在強(qiáng)大的證據(jù)支持下，該方法最終獲得專家認(rèn)可，經(jīng)過2016-2019的4年艱辛歷程，利民化學(xué)的代森錳鋅液相色譜法成功晉升為CIPAC方法。

3 方法提要

在小于20℃環(huán)境溫度下，試樣用緩沖液B溶解，以甲醇和緩沖液A為流動(dòng)相，使用以Agilent Extent C18為填料的液相色譜柱(色譜柱pH值耐受范圍為2.0～11.5)和紫外檢測(cè)器，在282nm處，對(duì)試樣中的代森錳鋅進(jìn)行高效液相色譜分離，外標(biāo)法定量。

典型色譜操作條件：流動(dòng)相： (甲醇+緩沖溶液A)=30+70(V/V) ， 經(jīng)濾膜過濾；柱溫：15℃；檢測(cè)器波長(zhǎng)：282nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣體積：5.0 μL；保留時(shí)間：約7.8min。

緩沖溶液A制備：稱取乙二胺四乙酸(EDTA)3.72g、磷酸氫二鈉1.42g、四丁基硫酸氫銨3.39g溶于1 000mL的水中，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至10.0。超聲混勻后用0.22μm膜過濾，備用。

緩沖溶液B制備：稱取EDTA 7.44g、磷酸氫二鈉1.42g、四丁基硫酸氫銨3.39g、亞硫酸鈉3g溶于1 000mL的水中，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至11.0。超聲混勻后靜置30min，備用。

4 成功申請(qǐng)CIPAC方法的意義及啟示

4.1 為下一步成功申請(qǐng)F(tuán)AO標(biāo)準(zhǔn)打好前站 CIPAC方法是申請(qǐng)F(tuán)AO標(biāo)準(zhǔn)的第一步，《FAO/WHO農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)制定和使用手冊(cè)》第2.9部分明確提到：FAO和WHO標(biāo)準(zhǔn)中使用的農(nóng)藥原藥和制劑有效成分的檢測(cè)方法，都要經(jīng)過CIPAC和AOAC協(xié)同驗(yàn)證與認(rèn)可，其中90%以上來自于CIPAC認(rèn)可的方法。成功晉升CIPAC方法為下一步申請(qǐng)代森錳鋅FAO標(biāo)準(zhǔn)打好了前站。

4.2 為利民化學(xué)代森錳鋅走向世界奠定了基礎(chǔ) FAO標(biāo)準(zhǔn)是全球認(rèn)可的鑒別同一藥劑不同產(chǎn)品質(zhì)量好壞的通用標(biāo)準(zhǔn)，可為產(chǎn)品質(zhì)量背書，獲得國(guó)際機(jī)構(gòu)和專家對(duì)其免費(fèi)的宣傳，更加便捷的競(jìng)標(biāo)聯(lián)合國(guó)和有關(guān)政府、公益組織的采購(gòu)項(xiàng)目，是產(chǎn)品走向國(guó)際市場(chǎng)的通行證和敲門磚。代森錳鋅CIPAC方法和FAO標(biāo)準(zhǔn)必將成為利民化學(xué)開拓國(guó)際代森錳鋅市場(chǎng)可用的兩張響當(dāng)當(dāng)?shù)拿?/p>

4.3 解決了全球代森錳鋅產(chǎn)品因分析方法導(dǎo)致的質(zhì)控難問題 代森錳鋅老方法存在操作復(fù)雜，重復(fù)性差，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室不易開展，且還需使用高毒試劑等諸多缺陷。新方法雖歷經(jīng)多次答辯，但CIPAC一直沒有放棄，繼續(xù)給與利民化學(xué)不斷完善的機(jī)會(huì)，就是因?yàn)樗麄円残枰粋€(gè)更加方便快捷的代森錳鋅CIPAC方法供全球代森錳鋅產(chǎn)品質(zhì)量控制之用，從另一個(gè)角度看，利民化學(xué)幫助CIPAC解決了這個(gè)難題。

4.4 對(duì)開展CIPAC全球驗(yàn)證試驗(yàn)的體會(huì) 從利民化學(xué)申請(qǐng)代森錳鋅CIPAC方法的歷程來看，除了方法開發(fā)本身，方法的申請(qǐng)者還需要重點(diǎn)關(guān)注

以下環(huán)節(jié)：CIPAC全球驗(yàn)證試驗(yàn)需要在CIPAC官網(wǎng)上發(fā)出通知，并明確參加實(shí)驗(yàn)室數(shù)量要求，實(shí)驗(yàn)室數(shù)量的確定既要考慮實(shí)驗(yàn)成本也需兼顧統(tǒng)計(jì)結(jié)果的可靠性；寄送試驗(yàn)樣品及標(biāo)樣前需了解目的地國(guó)家試驗(yàn)樣品管理政策，以避免寄送時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致樣品分解等，必要時(shí)可向CIPAC求助出具“試驗(yàn)樣品證明”；試驗(yàn)報(bào)告模板要求應(yīng)明確，以有利于試驗(yàn)完成后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并要求實(shí)驗(yàn)室提供部分原始數(shù)據(jù)以備試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)問題后有據(jù)可查；試驗(yàn)過程中保持與實(shí)驗(yàn)室的溝通，跟蹤試驗(yàn)進(jìn)程，對(duì)實(shí)驗(yàn)室提出的問題進(jìn)行及時(shí)答復(fù)；試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)過程中對(duì)出現(xiàn)的離群值或歧離值不能隨意剔除，需提供確鑿的證據(jù)支持。