AHLs類信號(hào)分子對(duì)IFFAS工藝影響研究

徐 嘉 蔚， 劉 濤

( 大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院, 遼寧 大連 116024 )

0 引 言

生物膜與活性污泥復(fù)合工藝在工業(yè)和城市污水處理中的應(yīng)用已有20多年的歷史[1]．該工藝兼具生物膜法和活性污泥法的優(yōu)勢(shì)，如對(duì)污染物處理能力強(qiáng)、抗沖擊負(fù)荷能力強(qiáng)、傳質(zhì)效率高[2-3]等，還能克服兩種工藝的弊端[4]．生物載體是該工藝的核心部分，其主要特點(diǎn)在于能夠維持反應(yīng)器內(nèi)較高的生物量濃度[5]．同時(shí)，相比固定式生物載體，可移動(dòng)的懸浮生物載體具有更優(yōu)越的性能，而基于懸浮生物載體的生物膜與活性污泥復(fù)合(integrated floating fixed-film activated sludge，IFFAS)工藝受到了廣泛的關(guān)注．

但I(xiàn)FFAS工藝普遍存在啟動(dòng)周期長(zhǎng)的問(wèn)題，這主要是由于傳統(tǒng)載體材料(如聚乙烯(PE)、聚丙烯)的生物親和性差，使得生物膜在載體表面的形成速度慢，從而導(dǎo)致工藝啟動(dòng)較慢[6]．因此，開(kāi)發(fā)新型載體以促進(jìn)微生物在載體表面的生長(zhǎng)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義．目前，對(duì)載體材料改良的主要方向是改變載體表面的理化性能．如向制備載體的原料中添加具有親水性的功能料以及具有正電荷性的功能料以改善微生物在載體表面的附著效果，或向原料中引入功能基團(tuán)(羰基等)以加速電子傳遞[7]．本課題組前期對(duì)載體親水親電性能的改性做了一系列的研究[7-9]，研究結(jié)果表明，改性載體較傳統(tǒng)載體具有更快的掛膜速度，其反應(yīng)器具有較強(qiáng)的污水處理能力，但載體表面的生物膜不穩(wěn)定、易脫落的現(xiàn)象仍然存在，因此，提高生物膜的穩(wěn)定性對(duì)污水處理有重要意義．

在以往的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，生物膜在某一時(shí)間段會(huì)有生物膜量突增的現(xiàn)象，而最新的研究表明，微生物的聚集行為不僅取決于環(huán)境條件，還取決于微生物間的一種被稱為群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)的效應(yīng)[10]．所謂群體感應(yīng)，是指微生物向環(huán)境中釋放某些物質(zhì)(信號(hào)分子)，其能夠在細(xì)胞間進(jìn)行自由擴(kuò)散，并隨著細(xì)胞密度的增加，信號(hào)分子濃度也不斷積累，當(dāng)達(dá)到一定閾值后，信號(hào)分子會(huì)進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，從而起到調(diào)控菌群的生態(tài)關(guān)系以及生理行為的作用[11]．迄今為止，由N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine-lactones，AHLs)類信號(hào)分子介導(dǎo)的QS被證明是參與生物膜形成和生長(zhǎng)的重要QS系統(tǒng)之一[12-13]．隨著對(duì)QS系統(tǒng)更加深入的研究，通過(guò)人為干預(yù)QS來(lái)調(diào)控細(xì)菌生理行為的方法受到了關(guān)注．有研究表明，向生物膜工藝中添加適當(dāng)適量的AHLs類信號(hào)分子，不僅能夠增加生物膜表面的生物量，還能夠改善系統(tǒng)處理效果[14-15]．此外，硝化細(xì)菌、厭氧氨氧化細(xì)菌以及反硝化細(xì)菌等水處理中重要的脫氮菌都被發(fā)現(xiàn)與QS密切相關(guān)[16-18]．

基于此，本研究通過(guò)向IFFAS系統(tǒng)中投加改性載體以及一定量的AHLs類信號(hào)分子，與活性污泥系統(tǒng)、投加傳統(tǒng)載體的IFFAS系統(tǒng)以及添加改性載體的IFFAS系統(tǒng)對(duì)比，考察在改性載體和群體感應(yīng)共同作用下的IFFAS工藝的掛膜效果和水處理效果，以期通過(guò)將群體感應(yīng)作用與改性載體協(xié)同，調(diào)控功能菌群，提高系統(tǒng)的掛膜速度并強(qiáng)化系統(tǒng)的污水處理能力，為IFFAS工藝的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)．

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 改性載體的制備

本研究所使用的改性載體和聚乙烯傳統(tǒng)載體均自主生產(chǎn)．改性載體的改性功能料為聚季銨鹽-10(PQAS-10)(2%，親水性、親電性)、斜發(fā)沸石(2%，氨吸附性)和滑石粉(1%，質(zhì)量控制)．將經(jīng)機(jī)械攪拌混勻的原料投入單螺桿擠出機(jī)，經(jīng)模具擠出成型，該過(guò)程中進(jìn)料階段、熔融階段、混合階段和擠出階段的筒區(qū)溫度分別為125、135、145、120 ℃．兩種載體均為中空?qǐng)A柱體，表面豎向伸展“鰭”，內(nèi)部有十字支撐，直徑和高均為10 mm，平均比表面積約為600 m2/m3．

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置與操作方法

1.3 分析方法

1.4 AHLs類信號(hào)分子的檢測(cè)

由于體系中AHLs的濃度很低，測(cè)試前需要進(jìn)行濃縮．參照Wang等[26]的研究，利用固相萃取技術(shù)(SPE)對(duì)樣品進(jìn)行1 000倍濃縮．SPE所用儀器為全自動(dòng)固相萃取儀(AT-280)，固相萃取柱為HLB(6 mL，Waters Oasis)，活化劑為甲醇和水，洗脫劑為甲醇．

采用液相色譜-四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent RRLC/6410)測(cè)量AHLs，根據(jù)胡惠秩[27]的研究和實(shí)際條件，確定超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)的參數(shù)，色譜條件為C18色譜柱(直徑4.6 mm，長(zhǎng)度150 mm，填料粒徑5 μm)，色譜分離流動(dòng)相：A為含有0.1%甲酸的超純水，B為含有0.1%甲酸的乙腈，流速0.25 mL/min梯度分離(乙腈30%開(kāi)始到60%止)，進(jìn)樣量為20 μL，保持柱溫40 ℃．質(zhì)譜條件為ESI(+)電噴霧離子源，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)，脫溶劑氣溫度為300 ℃，離子源溫度為100 ℃，去溶劑氣氮?dú)饬魉? L/min．

1.5 載體表面生物膜形態(tài)表征

將載體切割成條狀樣品，再對(duì)載體表面成熟期生物膜進(jìn)行固定、清洗、脫水、干燥、鍍金等預(yù)處理，后采用掃描電子顯微鏡(Hitachi S4800，日本)觀察生物膜形貌．

1.6 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

采集反應(yīng)器中污泥和載體表面生物膜樣品，參照說(shuō)明書(shū)(OMEGA試劑盒)提取樣品中的DNA，利用V4V5區(qū)引物(前端引物515F-5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′；后端引物907R-5′-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3′)對(duì)樣品中的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用歐易生物的Illumina Miseq測(cè)序儀(Illumina 2000)進(jìn)行高通量測(cè)序(high throughput sequencing，HTS)，再通過(guò)Trimmomatic、QIIME(split_libraries)等軟件進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 生物膜生長(zhǎng)情況

2.1.1 生物膜量的變化 生物膜在載體表面的形成可以看成是載體表面生物膜量的固定過(guò)程．微生物在載體表面的固定一般分為3個(gè)過(guò)程：微生物在水力作用下向載體表面遷移過(guò)程、可逆附著過(guò)程和不可逆附著過(guò)程[28]．每個(gè)過(guò)程的生物膜增長(zhǎng)速率有一定的差異．本實(shí)驗(yàn)R2、R3、R4生物膜量Q在生物膜形成過(guò)程中的變化如圖2所示．在反應(yīng)器啟動(dòng)初期(2周)，3個(gè)反應(yīng)器內(nèi)載體表面的生物膜量略有增長(zhǎng)(2周內(nèi)3組反應(yīng)器生物膜量不超過(guò)1 g/m2)，說(shuō)明該時(shí)期的微生物處于對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)階段．在第4至10周生物膜量一直處于增長(zhǎng)狀態(tài)，說(shuō)明該時(shí)期是生物膜快速形成的活躍期．在第10周之后生物膜量基本保持穩(wěn)定(較第2周增加了300%以上)，說(shuō)明此時(shí)生物膜基本成熟．

在生物膜的形成過(guò)程中，3組反應(yīng)器中載體表面生物膜量呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，R2、R3、R4反應(yīng)器中載體表面的生物膜量平均周增長(zhǎng)速率分別為0.34、0.44、0.46 g/(m2·周)．顯然，改性載體表面生物膜量增長(zhǎng)速率明顯大于傳統(tǒng)載體．當(dāng)生物膜量穩(wěn)定時(shí)，R2的生物膜量為3.28 g/m2，相比而言，改性載體表面生物膜量分別為4.33 g/m2(R3)和4.57 g/m2(R4)，說(shuō)明改性載體能夠顯著提高載體表面生物膜量，這主要?dú)w因于改性載體表面生物親和性的改善．而添加AHLs類信號(hào)分子的R4中載體表面的生物膜量較R3略有提高，說(shuō)明添加信號(hào)分子能夠增強(qiáng)微生物在載體上附著生長(zhǎng)的能力．

2.1.2 生物膜結(jié)構(gòu)的變化 生物膜中不同種群細(xì)菌之間的交聯(lián)主要和EPS有關(guān)，因此研究EPS在生物膜形成中的變化規(guī)律有助于考察生物膜結(jié)構(gòu)[29]．EPS組成較復(fù)雜，主要為多糖和蛋白質(zhì)，其比值(Qps/Qpn)能夠反映生物膜特性．本實(shí)驗(yàn)R2、R3、R4載體表面的EPS在生物膜形成過(guò)程中變化如圖3所示．

在掛膜過(guò)程中載體表面多糖和蛋白質(zhì)含量變化規(guī)律表現(xiàn)為均在增長(zhǎng)一段時(shí)間之后趨于平緩．當(dāng)載體表面的多糖和蛋白質(zhì)含量達(dá)到穩(wěn)定階段時(shí)，R3中載體表面的多糖和蛋白質(zhì)略高于R2中的，說(shuō)明改性載體相比傳統(tǒng)載體能夠增強(qiáng)生物膜的附著性和生物活性．而添加AHLs的R4反應(yīng)器中載體表面的多糖和蛋白質(zhì)含量明顯高于R2、R3中的，能夠達(dá)到0.34 g/m2(多糖)和1.38 g/m2(蛋白質(zhì))，分別是R2中載體表面的2.21倍和1.43倍，是R3中載體表面的1.85倍和1.07倍．說(shuō)明添加適量的AHLs類信號(hào)分子能夠促使微生物分泌蛋白質(zhì)和多糖，且其對(duì)多糖的促進(jìn)作用高于蛋白質(zhì)．

除此以外，有研究發(fā)現(xiàn)在生物膜的形成過(guò)程中，多糖和蛋白質(zhì)對(duì)形成生物膜的作用不同，多糖能夠起到黏附更多微生物的作用，而蛋白質(zhì)則保證了生物膜的抗沖擊能力，因此可以Qps/Qpn作為分析生物膜形成階段的指標(biāo)[30]．在該實(shí)驗(yàn)中，3組反應(yīng)器中載體的Qps/Qpn隨著生物膜的形成先達(dá)到峰值，并在第8周之后下降到一定水平并保持平緩．R3中載體的Qps/Qpn在前期比R2的高，在第10周與其基本一致，這可能是導(dǎo)致改性載體生物膜較傳統(tǒng)載體生物膜生長(zhǎng)快的因素之一．而添加一定量的信號(hào)分子后Qps/Qpn發(fā)生了明顯的變化，R4中載體上的Qps/Qpn在生物膜形成前期(第4周)達(dá)到了較高水平，分別是R2和R3中載體的2.16倍和1.74倍，在穩(wěn)定之后的Qps/Qpn仍比R2和R3高．這可能是由于外源信號(hào)分子對(duì)多糖分泌的影響比對(duì)蛋白質(zhì)分泌的影響更顯著，從而影響生物膜結(jié)構(gòu)，該結(jié)果與胡慧秩的研究結(jié)果一致[27]．

2.1.3 AHLs濃度的變化 實(shí)現(xiàn)群體感應(yīng)的信號(hào)分子種類很豐富，本研究選取了4種常見(jiàn)的AHLs類信號(hào)分子：C4-HSL、C8-HSL、3OHC12-HSL、C14-HSL．分別在反應(yīng)器運(yùn)行第4周和第14周時(shí)對(duì)4組反應(yīng)器中的AHLs含量進(jìn)行定量．各階段各反應(yīng)器中信號(hào)分子濃度如圖4所示．

在系統(tǒng)啟動(dòng)的第1～2周，微生物尚未適應(yīng)新環(huán)境，活性較低，分泌的信號(hào)分子較少，而系統(tǒng)為連續(xù)流，使得信號(hào)分子難以累積，因此幾乎所有AHLs信號(hào)分子濃度均低于檢測(cè)線，難以定量．第4周之后，微生物已適應(yīng)新環(huán)境，活性升高，分泌信號(hào)分子速率提高，系統(tǒng)中能夠檢測(cè)到AHLs并對(duì)其定量．第4周時(shí)，反應(yīng)器中不同類型的AHLs含量有差異，未添加信號(hào)分子的反應(yīng)器分泌的各類AHLs差異不大．第14周后未添加信號(hào)分子的系統(tǒng)內(nèi)AHLs濃度較第4周略有上升，說(shuō)明此時(shí)群體感應(yīng)細(xì)菌活躍度較高，能更快地分泌信號(hào)分子；而R4中的C4-HSL濃度卻比第4周時(shí)低，說(shuō)明這個(gè)時(shí)期反應(yīng)器內(nèi)添加的C4-HSL多被細(xì)菌接收消耗，結(jié)合前文得出的添加信號(hào)分子能夠改變生物膜結(jié)構(gòu)的結(jié)論，被消耗的C4-HSL可能是影響生物膜結(jié)構(gòu)的重要因素．

2.1.4 載體表面的微生物群落特征形貌 R2、R3、R4中載體表面的生物膜生長(zhǎng)穩(wěn)定后(第12周)，通過(guò)SEM觀察，結(jié)果如圖5所示．低倍鏡下，R2中傳統(tǒng)載體表面附著的生物膜塊較小且稀疏，R3中改性載體表面附著的生物膜塊較大且密集，而R4中改性載體表面附著的生物膜塊不僅大而密集，且有部分重疊層．在高倍鏡下觀察時(shí)能夠看出，R2中傳統(tǒng)載體表面的微生物以桿菌和少量菌絲交聯(lián)；R3中改性載體表面的微生物聯(lián)結(jié)明顯更加緊密，且除了桿菌還有較多球菌；而R4中改性載體表面的微生物形成的大團(tuán)簇更加明顯，細(xì)菌之間的聯(lián)結(jié)更加緊密．以上結(jié)果表明，微生物在R4中的載體表面附著效果最好，推測(cè)可能為添加的信號(hào)分子起了較大的作用．

2.2 污染物去除效果

2.2.1 COD去除效果 由于國(guó)內(nèi)生活污水碳氮比呈不斷降低的趨勢(shì)，為使出水總氮達(dá)標(biāo)，通常會(huì)在處理過(guò)程中投加外加碳源，從而增加了處理費(fèi)用．因此，本研究采用分階段降低進(jìn)水碳氮比的方式運(yùn)行，以節(jié)省進(jìn)水的碳源．第14周起，持續(xù)對(duì)4組反應(yīng)器中的化學(xué)需氧量進(jìn)出水濃度進(jìn)行測(cè)定，COD變化情況如圖6所示．

無(wú)論是高碳氮比(碳氮比為8，c(COD)=300 mg/L)還是低碳氮比(碳氮比為4，c(COD)=160 mg/L)的情況，溶解氧適中(c(DO)=(1.5±0.3) mg/L)或低(c(DO)=(0.8±0.3) mg/L)的情況，4組反應(yīng)器的出水COD基本能達(dá)到國(guó)家一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)(50 mg/L)．隨著進(jìn)水碳氮比的降低，COD去除率略有降低．在低碳氮比時(shí)，投加了載體的反應(yīng)器的COD平均去除率為81.2%～83.6%，高于僅有活性污泥的反應(yīng)器(R1)的COD平均去除率(76.8%)，說(shuō)明IFFAS工藝相比于活性污泥工藝更有助于去除污水中的COD，分析原因是由于載體能夠富集較多的異養(yǎng)菌，異養(yǎng)菌活性較大，能夠利用更多的COD．

在第2階段，保持溶解氧不變，降低進(jìn)水COD濃度以降低碳氮比到6，R4出水氨氮和總氮仍然很穩(wěn)定，而其他反應(yīng)器均出現(xiàn)了較大的波動(dòng)，且R2和R3出水已不能達(dá)到國(guó)家一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)．這說(shuō)明由于信號(hào)分子AHLs的加入，IFFAS系統(tǒng)能夠保持較好的穩(wěn)定性．與此同時(shí)，R2和R3反應(yīng)器內(nèi)出現(xiàn)了污泥膨脹的現(xiàn)象，其原因可能是曝氣不穩(wěn)定導(dǎo)致溶解氧在反應(yīng)器內(nèi)分布不均，形成部分區(qū)域溶解氧濃度過(guò)大，部分區(qū)域溶解氧濃度過(guò)小的情況，從而導(dǎo)致絲狀菌大量繁殖引起污泥膨脹．因此在這個(gè)階段之后降低溶解氧濃度并充分?jǐn)嚢枋狗磻?yīng)器內(nèi)部各個(gè)區(qū)域均保持在(0.8±0.3) mg/L．運(yùn)行一段時(shí)間之后污泥膨脹現(xiàn)象消失，R3和R4氨氮出水濃度能夠達(dá)到國(guó)家一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)，R4總氮出水濃度也能達(dá)到國(guó)家一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)．R1、R2、R3、R4的氨氮平均去除率分別為83.0%、85.7%、86.6%、94.8%，總氮平均去除率分別為48.0%、54.2%、55.9%、65.3%．顯然，R4的氨氮和總氮去除效果明顯優(yōu)于其他3組反應(yīng)器．分析原因，投加的改性載體較傳統(tǒng)載體有更好的親水性和親電性，更有利于富集硝化菌和反硝化菌，且改性載體中的功能料天然沸石能夠吸附氨氮，從而促進(jìn)硝化菌快速生長(zhǎng)[9]；而添加AHLs不僅能夠改變載體表面生物膜結(jié)構(gòu)，使其更有利于微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)，AHLs還能促進(jìn)硝化和反硝化效果．因此，R4表現(xiàn)出更強(qiáng)的脫氮能力．

在第4階段繼續(xù)降低碳氮比為4．此時(shí)除R1外的3組反應(yīng)器的出水氨氮濃度均能滿足國(guó)家一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)，但出水總氮濃度有所上升．值得注意的是，R4的總氮去除效果較其他反應(yīng)器好，去除率為58.8%，但較前三階段有所下降．可能由于該條件下碳源較少，不能為反硝化提供足夠的電子受體，從而導(dǎo)致了硝態(tài)氮和亞態(tài)氮的積累．

2.3 細(xì)菌群落分析

2.3.1 多樣性 在研究不同條件下污染物去除效果的實(shí)驗(yàn)第4階段結(jié)束后，對(duì)R1、R2、R3和R4中的懸浮污泥以及R2、R3和R4中載體表面的生物膜進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序后分析樣本內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征．其群落結(jié)構(gòu)多樣性以及豐富度指數(shù)如表1所示．本次測(cè)序覆蓋率均達(dá)到99%以上，說(shuō)明本次測(cè)序結(jié)果可靠．從每個(gè)樣本中獲得至少31 701個(gè)有效序列，7個(gè)樣本可分別獲得432～523個(gè)操作分類單元．Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)均能估算群落分布多樣性．

表1 不同反應(yīng)器中懸浮污泥和載體表面的微生物豐富度指數(shù)

由表1可得，R2、R3和R4中載體表面的微生物群落多樣性均大于其反應(yīng)器中懸浮污泥的，說(shuō)明載體不僅能夠富集更多的生物量，還能吸引更多的微生物種類在其上生長(zhǎng)．傳統(tǒng)載體和改性載體表面的微生物群落多樣性差別不大，但添加AHLs后載體表面的細(xì)菌多樣性卻相對(duì)下降，結(jié)合其生物活性和污染物降解效果較強(qiáng)的結(jié)果，分析出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是受AHLs類群體感應(yīng)調(diào)控作用的影響，載體表面某些功能菌的含量相對(duì)增加，而有一些細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中被淘汰．

2.3.2 細(xì)菌群落 從門水平分析，4組反應(yīng)器中的懸浮污泥樣品和載體表面生物膜樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，添加了AHLs的R4生物膜中的擬桿菌門比例比其他反應(yīng)器中的高，但硝化螺旋菌門(Nitrospirae)卻較低，分析原因可能是AHLs對(duì)擬桿菌門的影響比對(duì)硝化螺旋菌門的影響大．

從目水平下進(jìn)一步分析細(xì)菌群落，將系統(tǒng)中的功能菌目分為6種類型，分類結(jié)果如表2所示．R3中的聚磷菌總占比明顯高于R2，而R4中反硝化菌和聚磷菌的優(yōu)勢(shì)更加明顯，這能夠解釋前文硝化速率變化與反硝化速率變化有差異的原因．說(shuō)明改性載體的投加對(duì)反硝化菌的富集更有效果，而添加AHLs類信號(hào)分子能夠強(qiáng)化反硝化菌的生長(zhǎng)能力．且R4中的硝化菌比R3占比低，但污染物降解效果卻仍有提升，說(shuō)明添加AHLs類信號(hào)分子也能提高硝化菌的硝化效率．

表2 目水平功能微生物菌群及比例

從污染物降解的角度看，投加載體能夠?yàn)椴煌?xì)菌提供生長(zhǎng)環(huán)境，改性載體能夠促進(jìn)微生物的掛膜生長(zhǎng)，而添加AHLs類信號(hào)分子能夠極大程度地提高一些反硝化菌的生長(zhǎng)與活性．這對(duì)于IFFAS工藝?yán)酶男暂d體和群體感應(yīng)現(xiàn)象提高處理能力提供了新的思路．

3 結(jié) 語(yǔ)

相比于傳統(tǒng)載體，添加改性材料的載體生物親和性較好，載體表面生物膜量增長(zhǎng)速率較快，生物膜生長(zhǎng)穩(wěn)定后載體表面生物膜量較高，在AHLs作用下的改性載體具有較高的蛋白質(zhì)和多糖含量．改性載體和AHLs的共同作用，使得反應(yīng)器具有更高的COD、氨氮和總氮去除效果，且對(duì)低碳氮比水質(zhì)具有更好的適應(yīng)性．此外，AHLs能夠明顯提高反硝化菌Zoogloea的相對(duì)豐度．