圍產(chǎn)期孕婦B群鏈球菌三種篩查方法的評(píng)估

張昭勇，楊宏偉，張吉才

B群鏈球菌(group B streptococcus, GBS)又名無(wú)乳鏈球菌，是一種共生的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，常定植于人體的直腸和泌尿生殖道。圍產(chǎn)期孕婦生殖道或直腸定植的GBS可以在分娩期間垂直傳播，常引起新生兒GBS感染。據(jù)報(bào)道，全世界大約18%的孕婦發(fā)生陰道直腸GBS定植，不同地區(qū)定植率從13%～35%不等[1]。國(guó)內(nèi)報(bào)道圍產(chǎn)期孕婦GBS定植率約9.06%，提示準(zhǔn)確檢測(cè)GBS至關(guān)重要，因?yàn)楫a(chǎn)時(shí)抗生素的使用可以顯著減少新生兒GBS感染[2]。

圍產(chǎn)期孕婦GBS篩查正受到全世界的高度重視，2010年美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(centers for disease control and prevention，CDC)修訂了“預(yù)防圍產(chǎn)期B組鏈球菌疾病指南”，建議對(duì)35～37周?chē)a(chǎn)期孕婦進(jìn)行GBS定植篩查[3]，我國(guó)“孕前和孕期保健指南(2011年)”也對(duì)此篩查進(jìn)行了推薦。目前GBS篩查方法包括細(xì)菌培養(yǎng)、免疫層析和分子生物學(xué)等。雖然傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，但是耗時(shí)耗力，專(zhuān)業(yè)技術(shù)要求高；免疫層析法操作方便簡(jiǎn)單，半小時(shí)內(nèi)可以出結(jié)果，但是敏感性和特異性存在不足[4]。Xpert GBS LB系統(tǒng)是一種全新的快速檢測(cè)GBS的全自動(dòng)一體化半定量巢式實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)，可以在2 h內(nèi)快速對(duì)樣本進(jìn)行核酸提取、純化及濃縮檢測(cè)。該系統(tǒng)可直接檢測(cè)標(biāo)本，也可對(duì)增菌或分離后的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，有報(bào)道稱(chēng)其敏感性較顯色肉湯增菌培養(yǎng)法提高10%～15%[5]。為了對(duì)上述GBS篩查方法進(jìn)行合理評(píng)估，筆者對(duì)1063份圍產(chǎn)期孕婦生殖道或直腸標(biāo)本進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，以顯色肉湯增菌培養(yǎng)法作為GBS篩查的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)Xpert GBS LB法、免疫層析法和普通培養(yǎng)法進(jìn)行診斷效能評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2019年4—6月湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科門(mén)診行GBS篩查圍產(chǎn)期孕婦(35～37周)1063例,年齡21～43(26.8±12.98)歲。

1.2儀器與試劑 美國(guó)賽沛GeneXpert Dx System及Xpert GBS LB試劑盒，DL-GBS 96培養(yǎng)分析系統(tǒng)及鏈球菌選擇性顯色肉湯培養(yǎng)基(珠海迪爾生物有限公司提供)，哥倫比亞血瓊脂平板，DL-96細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及鑒定板，GBS膠體金快速檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州輝康生物科技有限公司。

1.3標(biāo)本采集及檢測(cè)方法

1.3.1標(biāo)本采集：由產(chǎn)科醫(yī)師采集孕35～37周孕婦陰道(897例)或直腸(166例)拭子標(biāo)本于運(yùn)輸培養(yǎng)基中立即送檢。

1.3.2Xpert GBS LB檢測(cè)：取采集標(biāo)本棉簽于樣本處理液中充分混勻，震蕩后室溫孵育15 min，取2 ml上清液加入檢測(cè)試劑盒并加載到GeneXpert Dx System，大約2 h內(nèi)自動(dòng)完成GBS檢測(cè)。

1.3.3GBS普通培養(yǎng)及顯色肉湯增菌培養(yǎng)：GBS普通培養(yǎng)：取采集標(biāo)本棉簽接種哥倫比亞血瓊脂平板，35℃、5% CO2孵育18～24 h后，挑取可疑菌落革蘭染色陽(yáng)性、觸酶陰性初步鑒定后，進(jìn)行CAMP試驗(yàn)和DL-96細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng)鑒定。GBS顯色肉湯增菌培養(yǎng)：取GBS選擇性顯色培養(yǎng)基置室溫平衡，將稀釋液倒入凍干粉中，混勻溶解，將采集的標(biāo)本拭子插入培養(yǎng)瓶充分洗脫標(biāo)本，然后加封1.5 ml礦物油，旋緊蓋子，放置DL-GBS 96培養(yǎng)分析系統(tǒng)，8～48 h自動(dòng)報(bào)告結(jié)果。

1.3.4GBS免疫層析法檢測(cè)：取1、2號(hào)抽提液各5滴，混勻；將采集標(biāo)本棉簽插入充分洗脫標(biāo)本，取出3滴混合洗脫液，加入樣品孔內(nèi)；放置8～10 min后讀取結(jié)果。陽(yáng)性為在質(zhì)控區(qū)與測(cè)試區(qū)同時(shí)出現(xiàn)紅線(xiàn)；陰性：質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)紅線(xiàn)，測(cè)試區(qū)不出現(xiàn)紅線(xiàn)；無(wú)效：質(zhì)控區(qū)不出現(xiàn)紅線(xiàn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.4.1樣本含量估算：估計(jì)該試驗(yàn)敏感度為85%，特異性為80%，設(shè)允許誤差Δ=0.10，α=0.05，Zα=1.96(雙側(cè))。則病例組樣本量=1.962×0.90×(1-0.90)/0.102=49；對(duì)照組樣本量=1.962×0.80×(1-0.80)/0.102=92，研究樣本多于最少估計(jì)例數(shù)，具有研究意義。

1.4.2一致性檢驗(yàn)：Kappa一致性檢驗(yàn)評(píng)價(jià)不同檢測(cè)方法的一致性，當(dāng)κ<0表示一致性強(qiáng)度極差，當(dāng)κ為0～0.20時(shí)表示一致性強(qiáng)度微弱，當(dāng)κ為0.21～0.40時(shí)表示一致性強(qiáng)度弱，當(dāng)κ為0.41～0.60時(shí)表示一致性強(qiáng)度中度，當(dāng)κ為0.61～0.80時(shí)表示一致性強(qiáng)度高度，當(dāng)κ為0.81～1.00時(shí)表示一致性強(qiáng)度極強(qiáng)。Kappa值的假設(shè)檢驗(yàn)，U>1.96、P<0.05可認(rèn)為兩種測(cè)定方法結(jié)果具有一致性[6]。

1.4.3診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)：以顯色肉湯增菌培養(yǎng)法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，計(jì)算3種篩查方法的敏感性、特異性、陰/陽(yáng)性預(yù)測(cè)值等性能指標(biāo)。χ2檢驗(yàn)比較不同方法的陽(yáng)性檢出率，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.13種GBS篩查方法檢測(cè)結(jié)果及一致性比較 與顯色肉湯增菌培養(yǎng)法比較，Xpert GBS LB法和普通培養(yǎng)法具有極強(qiáng)的一致性，免疫層析法僅具有中度一致性，見(jiàn)表1。

表1 3種GBS篩查方法檢測(cè)結(jié)果及一致性比較

2.2不同GBS篩查方法陽(yáng)性檢出率比較 與“金標(biāo)準(zhǔn)”顯色肉湯增菌培養(yǎng)法比較，Xpert GBS LB和免疫層析法檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，普通培養(yǎng)法檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同GBS篩查方法陽(yáng)性檢出率比較

2.33種GBS篩查方法診斷效能評(píng)價(jià) 3種篩選方法中，普通培養(yǎng)法特異性最高，Xpert GBS LB敏感性最高，而免疫層析法的敏感性和特異性均較差，見(jiàn)表3。

表3 3種GBS篩查方法診斷效能評(píng)價(jià)

3 討論

20世紀(jì)70年代，GBS感染成為美國(guó)新生兒發(fā)病率和病死率升高的主要原因，最初報(bào)告顯示病死率高達(dá)50%。母親泌尿生殖道或胃腸道中GBS定植是該類(lèi)疾病的主要危險(xiǎn)因素，一項(xiàng)經(jīng)典的前瞻性隊(duì)列研究表明，GBS生殖道定植的孕婦較GBS培養(yǎng)陰性孕婦發(fā)生新生兒GBS感染的可能性高25倍以上[7]。因此，圍產(chǎn)期孕婦GBS篩查和產(chǎn)前抗生素的預(yù)防成為降低新生兒GBS感染率和病死率的重要措施[8-9]。自2002年美國(guó)CDC指南發(fā)布以來(lái)，細(xì)菌培養(yǎng)已成為圍產(chǎn)期孕婦GBS篩查的“金標(biāo)準(zhǔn)”。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)法敏感性較低，2010年美國(guó)CDC指南將顯色肉湯增菌培養(yǎng)法推薦為GBS定植篩查的“金標(biāo)準(zhǔn)”。雖然基于培養(yǎng)的GBS篩查極大降低了新生兒GBS感染相關(guān)疾病的發(fā)病率和病死率，但是培養(yǎng)法對(duì)人員素質(zhì)的高要求和速度較慢的特點(diǎn)已無(wú)法滿(mǎn)足臨床快速篩查的需求[10]。鑒于傳統(tǒng)培養(yǎng)法的固有缺點(diǎn)，臨床亟需一種快速、靈敏、高特異性的新型篩查方法。目前針對(duì)GBS快速篩查方法主要包括免疫層析法和Xpert GBS LB法，對(duì)這些新型方法篩查效能進(jìn)行合理評(píng)估有利于臨床做出合理選擇。

Xpert GBS LB系統(tǒng)是一種全新的快速檢測(cè)GBS的全自動(dòng)一體化半定量巢式實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)，主要通過(guò)檢測(cè)GBS cfb基因區(qū)域從而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。該系統(tǒng)可以在2 h內(nèi)快速對(duì)樣本進(jìn)行核酸提取、純化及濃縮檢測(cè)。Xpert GBS LB法可直接檢測(cè)標(biāo)本，也可對(duì)增菌或分離后的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)的檢測(cè)極限報(bào)告為131 cfu/ml。GBS普通培養(yǎng)法檢測(cè)極限為10～100 cfu/ml，但在本研究中其敏感性低于Xpert GBS LB法。Xpert GBS LB法較高敏感性的原因包括：通過(guò)檢測(cè)死亡細(xì)菌細(xì)胞中的殘留DNA而得到增強(qiáng)，而培養(yǎng)標(biāo)本未能及時(shí)處理和可能導(dǎo)致部分活菌死亡使得培養(yǎng)敏感性下降；鑒定了培養(yǎng)物中遺漏的非β-溶血性GBS。Xpert GBS LB法可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，其原因可能是GBS cfb基因區(qū)域染色體缺失所致[11-12]。本研究中Xpert GBS LB法高敏感性證明了使用分子方法檢測(cè)GBS可有效提高圍產(chǎn)期孕婦攜帶者的檢出率，從而可能進(jìn)一步降低早發(fā)性GBS感染的發(fā)生率。

GBS免疫層析法是通過(guò)標(biāo)記的單克隆抗體與GBS抗原特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物,而被固相多克隆抗體捕捉呈現(xiàn)紅色色帶即陽(yáng)性。臨床分離的GBS特異性莢膜多糖類(lèi)型繁多，已知的血清型多達(dá)十余種，即Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ型。因此，使用莢膜多糖作為抗原靶標(biāo)可能使情況變得十分復(fù)雜，與GBS親緣關(guān)系較近的A群、草綠色鏈球菌均可能導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生[13-14]。本研究中免疫層析法雖然陽(yáng)性檢出率為24.55%，但是其中10.15%為假陽(yáng)性結(jié)果，主要原因是生殖道或腸道正常菌群復(fù)雜引起的交叉反應(yīng)導(dǎo)致。在3種檢測(cè)方法中，免疫層析法的一致性最差，這提示我們對(duì)該方法需要尋找更加特異的抗原抗體。雖然免疫層析法的敏感性和特異性均存在一定的不足，但是該法簡(jiǎn)便易操作，對(duì)檢驗(yàn)人員要求低，可以在比較簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，因此是基層醫(yī)院可行的一種方法。

普通培養(yǎng)法既往長(zhǎng)期作為GBS篩查的“金標(biāo)準(zhǔn)”，敏感性過(guò)低是其主要缺點(diǎn)。在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)普通培養(yǎng)法的陽(yáng)性檢出率最低。普通培養(yǎng)法的另外一個(gè)缺點(diǎn)是操作煩瑣，需24 h或更長(zhǎng)時(shí)間才能獲得培養(yǎng)結(jié)果，并且需要專(zhuān)業(yè)的微生物人員才能完成[15]。當(dāng)孕婦攜帶的病原菌負(fù)荷比較低或接種標(biāo)本量不足可導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。其次，臨床約5%的非β-溶血性GBS可能被檢驗(yàn)人員認(rèn)為是草綠色鏈球菌丟棄而漏診。但是，普通培養(yǎng)法與顯色肉湯增菌培養(yǎng)法一致性及診斷特異性高為臨床所認(rèn)可，特別是能夠?yàn)榕R床提供完善的藥物敏感性結(jié)果，并且可以監(jiān)測(cè)定植菌株的耐藥變遷，因此是臨床不可或缺的重要環(huán)節(jié)[16]。

總之，臨床常用的3種GBS篩查方法，與臨床“金標(biāo)準(zhǔn)”顯色肉湯增菌培養(yǎng)法比較，Xpert GBS LB法和普通培養(yǎng)法具有很高的一致性，免疫層析法僅具有中度一致性。3種方法各有優(yōu)劣點(diǎn)，免疫層析法操作簡(jiǎn)單易行，適合于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)開(kāi)展；普通培養(yǎng)法特異性高，可以為臨床提供全面的篩查和藥物敏感性結(jié)果；Xpert GBS LB法在檢測(cè)效能上優(yōu)于免疫層析法和普通培養(yǎng)法，可有效提高圍產(chǎn)期孕婦GBS感染檢出率，降低早發(fā)性GBS感染發(fā)生率。