第三代和第四代丙型肝炎病毒抗體ELISA檢測試劑在血站血液檢測中的應(yīng)用分析*

袁 婷，張 利△，彭 濤，楊俊龍，林 琴，葉森林，周 霞

(1.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院輸血科，四川成都 610083；2.四川省遂寧市中心血站，四川遂寧 629000；3.四川省眉山市中心血站，四川眉山 620010；4.成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，四川成都 610083)

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全球丙型肝炎病毒(HCV)的感染率約為3%,感染者約有2億人,每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬例，其中50%～80%的感染者無明顯癥狀并可進展為慢性感染,20%的感染者最終可進展為肝硬化甚至肝細胞癌[1]。我國1～59歲人群HCV感染率為0.43%，輸血存在較高的感染風(fēng)險[2]，阻斷HCV傳播對保障血液安全至關(guān)重要。目前國內(nèi)大多采用第三代酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑檢測丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)，雖然第三代試劑較第四代試劑價格低廉，但可能存在更高的假陽性率[3]或漏檢率。本研究就兩個不同廠家各自生產(chǎn)的第三代和第四代抗-HCV ELISA檢測試劑在血站檢測的陽性率、單試劑陽性率、靈敏度和假陽性率進行對比，為血站選擇適合的抗-HCV ELISA試劑提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇某血站2016年3月至2019年3月采集的37 826例無償獻血者血液標本，將37 826例標本中采用廠家1第三代和廠家2第四代抗-HCV ELISA試劑檢測結(jié)果為陽性的137例血漿標本于-40 ℃凍存。

1.2儀器與試劑 廠家1和廠家2提供的抗-HCV ELISA檢測試劑(分別為廠家1第三代、廠家1第四代、廠家2第三代、廠家2第四代)，康徹斯坦標準物質(zhì)，羅氏乙型肝炎病毒-丙型肝炎病毒-人類免疫缺陷病毒(1+2型)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法，cobas TaqScreen MPX Test,version 2.0)。試劑均通過中國藥品生物制品批批檢驗合格，并在有效期內(nèi)。第三代抗-HCV ELISA檢測試劑原理為間接ELISA法，第四代抗-HCV ELISA檢測試劑原理為雙抗原夾心ELISA法。主要儀器包括艾德康ELISA1100全自動酶免系統(tǒng)，羅氏cobas s201核酸檢測系統(tǒng)，儀器均定期校準合格。

1.3方法 回顧性分析37 826例無償獻血者血樣采用廠家1第三代和廠家2第四代抗-HCV ELISA試劑篩查抗-HCV的結(jié)果。將凍存的137例檢測陽性的血漿標本，采用廠家1第四代和廠家2第三代抗-HCV ELISA試劑進行檢測，并采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定性檢測HCV-RNA以進行確證，分別比較兩個廠家第三代和第四代試劑的靈敏度和假陽性率。檢測步驟均嚴格按試劑說明書進行。

1.4結(jié)果判定 ELISA：S代表標本的吸光度(A值)，cut off值=陰性對照孔平均A值+0.12，二者之比即為S/CO值,S/CO≥0.5為陽性,S/CO<0.5為陰性。雙試劑陽性：兩種試劑檢測結(jié)果均為陽性；單試劑陽性：僅其中一種試劑檢測結(jié)果為陽性，且用該試劑雙孔復(fù)查結(jié)果仍為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理和分析。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間結(jié)果的比較采用χ2檢驗。靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；假陽性率=假陽性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.137 826例獻血者抗-HCV檢測結(jié)果 廠家1第三代和廠家2第四代試劑雙陽性率為0.12%(44/37 826)；總陽性數(shù)137例，總陽性率為0.36%(137/37 826)。其中廠家1第三代試劑陽性率為0.32%(122/37 826),廠家2第四代試劑陽性率為0.16%(59/37 826)，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.981，P<0.05)。廠家1第三代試劑單陽性率為0.21%(78/37 826)，廠家2第四代試劑單陽性率為0.04%(15/37 826)，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=42.730，P<0.05)。見表1。

表1 37 826例無償獻血者抗-HCV ELISA檢測結(jié)果(n)

2.2137例凍存標本抗-HCV檢測結(jié)果以及靈敏度、假陽性率比較 廠家1第三代試劑靈敏度為86.54%(45/52)，廠家1第四代試劑靈敏度為98.08%(51/52)，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.875，P=0.027)。廠家1第三代試劑假陽性率為90.59%(77/85)，廠家1第四代試劑假陽性率為5.88%(5/85)，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=122.129，P<0.05)。廠家2第三代試劑靈敏度為92.31%(48/52)，廠家2第四代試劑靈敏度為98.08%(51/52)，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.891，P=0.169)。廠家2第三代試劑假陽性率為35.29%(30/85)，廠家2第四代試劑假陽性率為9.41%(8/85)，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.404，P<0.05)。見表2～5。

表2 廠家1第三代試劑檢測結(jié)果(n)

表3 廠家1第四代試劑檢測結(jié)果(n)

表4 廠家2第三代試劑檢測結(jié)果(n)

表5 廠家2第四代試劑檢測結(jié)果(n)

3 討 論

從2.1結(jié)果可以看出：廠家1第三代試劑陽性率為0.32%，廠家2第四代試劑陽性率為0.16%；廠家1第三代試劑單陽性率為0.21%，廠家2第四代試劑單陽性率為0.04%。廠家1第三代和廠家2第四代試劑的陽性率、試劑單陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，因此懷疑第三代試劑假陽性率過高。從表2～5可以發(fā)現(xiàn)，與同一廠家的第三代試劑比較，兩個廠家第四代試劑的靈敏度更高、假陽性率更低。137例ELISA試劑檢測陽性的獻血者標本經(jīng)PCR確認52例HCV-RNA陽性，85例為陰性。廠家1第三代試劑陽性122例，經(jīng)過PCR確認45例HCV-RNA陽性，靈敏度為86.54%，假陽性率為90.59%。廠家1第四代試劑陽性56例，經(jīng)過PCR確認51例HCV-RNA陽性，靈敏度為98.08%,假陽性率為5.88%。廠家1第三、四代試劑的靈敏度和假陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。廠家2第三代試劑陽性78例，經(jīng)過PCR確認，48例HCV-RNA陽性,靈敏度為92.31%，假陽性率為35.29%。廠家2第四代試劑陽性59例，經(jīng)過PCR確認，51例HCV-RNA陽性，靈敏度為98.08%,假陽性率為9.41%。廠家2第三、四代試劑靈敏度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，二者假陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。137例標本經(jīng)HCV-RNA確認，兩個廠家第三、四代試劑均存在漏檢情況：廠家1第三代試劑漏檢7例，廠家2第三代試劑漏檢4例，廠家1和廠家2第四代試劑均漏檢1例。

血液為珍稀資源，抗-HCV陽性是成品血報廢的主要原因之一[4]，相關(guān)標準要求獻血者血液檢驗既要有較高的靈敏度保證血液安全，又要有較低的假陽性率以減少不必要的血液浪費?！堆静僮骷夹g(shù)規(guī)范》(2019版)規(guī)定：無償獻血者血液抗-HCV血清學(xué)檢測方法包括ELISA法、化學(xué)發(fā)光免疫分析試驗(CLIA)[5]。ELISA法是目前抗-HCV檢測的主要方法，具有靈敏度高、特異性強、自動化程度高、可定量和半定量測定、檢測成本低等優(yōu)點[6]，缺點是容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，可能與下列因素有關(guān)：標本溶血、被細菌污染、貯存時間過長和標本凝固不全等標本處理問題；試劑盒的抗原不純、采用多克隆抗體和酶結(jié)合物純度低等試劑盒方面的問題；加樣時間過長造成加樣后放恒溫箱前等待時間過長，加樣后孔壁上貼有微小血塊等問題；洗板針堵塞，抽吸不完全，洗液量不足，洗板次數(shù)少等問題[6-7]。

本研究中選用的兩個廠家第三代抗-HCV ELISA檢測試劑應(yīng)用間接ELISA法檢測免疫球蛋G(IgG)類抗-HCV，第四代試劑應(yīng)用雙抗原夾心ELISA法檢測IgG類和免疫球蛋白M(IgM)類HCV總抗體。兩個廠家第四代試劑較其第三代試劑有更高的靈敏度和更低的假陽性率的原因：(1)間接ELISA法雖是臨床應(yīng)用率較高的一種血清學(xué)抗-HCV檢測方法，但第三代試劑只能檢測血清中的IgG類抗體，對早期HCV感染存在一定漏檢[8]，第四代試劑因其在第三代試劑檢測IgG類抗體基礎(chǔ)上增加了IgM類抗體的檢測，能提高處于感染早期標本的檢出率，縮短病毒感染檢出的“窗口期”[9-10]；(2)間接法以酶標記的抗人IgG為二抗，血清中含量較高的IgG及類風(fēng)濕因子等非特異性吸附易引起假陽性反應(yīng)[8]；(3)雙抗原夾心ELISA法用酶標記抗原，形成包被抗原-檢測抗體-生物素抗原結(jié)構(gòu)，對被檢抗-HCV給予二次特異性反應(yīng)，可有效避免間接法導(dǎo)致的假陽性現(xiàn)象[10]；(4)雙抗原夾心ELISA法在試驗的第一步加入生物素化的HCV抗原，對ELISA反應(yīng)結(jié)果有放大效果，有利于提高試劑的最低檢出限[9]；(5)加樣的精確性直接影響后續(xù)的試驗結(jié)果，從第三代試劑的加樣量10 μL變?yōu)榈谒拇噭┑?0 μL，在相同的加樣精密度條件下,10 μL的加樣誤差相比50 μL的加樣誤差更大[11-13]。

本研究顯示，所使用的兩個不同廠家第三代檢測試劑靈敏度均低于第四代試劑，第三代試劑漏檢風(fēng)險更高，假陽性率也更高。血站采用兩個不同廠家的抗-HCV ELISA試劑檢測獻血者抗-HCV,任意一種試劑呈陽性,血液便不能用于臨床,導(dǎo)致血液報廢，獻血者也因此被列入獻血黑名單，不能再次參與獻血,這種策略雖有利于確保血液安全,但勢必也會造成血液資源的浪費[14]和獻血者流失[15]?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程》(2019版)提出開展核酸檢測同時只要求進行1次血清學(xué)檢測，采用先血清學(xué)檢測再對陰性標本進行核酸檢測的檢測策略。在該檢測策略下，選擇第四代抗-HCV ELISA試劑相較于第三代試劑，不僅靈敏度高，能更好地保障血液安全，而且假陽性少，可在一定程度上提高檢出率，同時減少不必要的血液浪費，避免對獻血者造成不必要的心理負擔，減少獻血者流失[15]。該檢測策略亦能有效降低血清學(xué)陽性標本污染核酸實驗室的風(fēng)險，更好地促進血站血液檢驗及無償獻血工作的開展。