手足口病病毒核酸及抗體檢測的比較研究及應用*

趙 云，蔡晶娟△，彭 程，王紫荊，尹清金，孫照華，牟 楊，盧亞陵，蔣 燕，宋曉燕

(1.成都兒童專科醫(yī)院，四川成都 610015；2.四川省廣安市人民醫(yī)院，四川廣安 638001；3.成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川成都 610091)

手足口病是一種由腸道病毒感染所引起的傳染性疾病，其主要的病原體包括腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(CA16)，好發(fā)于5歲以下的兒童[1-2]。重癥病例可并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、心肌炎、神經(jīng)源性肺水腫等，患兒早期臨床癥狀不典型、病情常急轉直下，往往在發(fā)病早期突然出現(xiàn)預后不良的情況，并由此引發(fā)醫(yī)患矛盾[3-4]。對手足口病患兒實施隔離可切斷手足口病的傳染源，是預防手足口病流行的重要措施，而患兒的排毒時間是制訂隔離期的重要參考。極少數(shù)重癥患兒皮疹不典型，臨床診斷困難。因此，對手足口病患兒進行實驗室早期診斷以及對EV71與CA16等腸道病毒的感染進行準確鑒別就顯得非常重要[5-6]。本研究采用腸道病毒核酸檢測聯(lián)合血清學抗體檢測方法，探討該方法在手足口病診斷及防控中的臨床應用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年5月至2019年2月在成都兒童?？漆t(yī)院就診的手足口病患兒，臨床診斷均符合2018年國家衛(wèi)生健康委員會制定的《手足口病診療指南(2018年版)》標準，使用RNA恒溫擴增檢測技術(SAT)對手足口病患兒進行EV71及CA16核酸檢測，同時采用膠體金法(金標法)對患兒血清中的EV71、CA16特異性IgM抗體進行聯(lián)合檢測。將上述檢測方法中任意一項出現(xiàn)陽性的患兒納入研究。納入290例手足口病患兒，其中男170例，女120例；年齡4個月至11歲，中位年齡2.9歲，<1歲患兒28例，1～5歲患兒225例，>5歲的患兒37例。排除標準:(1)家長不合作或失訪的患兒;(2)初診時病毒核酸及抗體標本檢測均為陰性的患兒。本研究經(jīng)成都兒童專科醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，入組患兒的監(jiān)護人均已簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 實時熒光定量PCR儀由西安天隆科技有限公司生產(chǎn)，型號為TL988；試劑采用北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的CA16和EV71 IgM抗體檢測試劑盒(膠體金法)。

1.3方法

1.3.1核酸檢測方法 通過SAT，以病原體特異的16s rRNA為靶標，在M-MLV反轉錄酶和T7 RNA多聚酶的作用下進行恒溫擴增，產(chǎn)生的大量RNA與帶有熒光標記的優(yōu)化探針特異性結合，擴增信號和熒光信號的檢測同步進行，從而實現(xiàn)了病原體的快速檢測。

1.3.2血清學抗體檢測方法 將采集的全血標本立即進行離心，取上清液，血清標本嚴格按照試劑盒說明書上的操作流程進行檢測。

1.4觀察指標 比較初診及病程2周的復診患兒CA16、EV71核酸和CA16、EV71抗體檢測結果。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理和分析。計數(shù)資料以百分率或例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，等級資料比較采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1兩種檢測方法在不同年齡初診患兒中的檢出率比較 初診患兒中EV71核酸檢測陽性17例(5.9%)，CA16核酸檢測陽性81例(27.9%)，核酸檢出率為33.8%(98例)；EV71血清學抗體檢測陽性153例(52.8%)，CA16血清學抗體檢測陽性183例(63.1%)，血清學抗體檢出率為84.5%(245例，其中雙抗體陽性91例)。兩種檢測方法檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩種方法聯(lián)合檢測陽性286例(98.6%)。<1歲初診患兒核酸檢測陽性5例，抗體檢測陽性24例，兩種檢測方法檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；1～5歲初診患兒兩種檢測方法檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；>5歲初診患兒兩種檢測方法檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同年齡初診患兒兩種檢測方法結果比較(n)

2.2兩種檢測方法在不同年齡復診患兒中的檢出率比較 復診患兒中核酸檢測陽性49例(16.9%)，其中EV71核酸檢測陽性11例(3.8%)，CA16核酸檢測陽性38例(13.1%)。抗體檢測陽性240例(82.8%)，其中EV71血清學抗體檢測陽性177例(61.0%)，CA16血清學抗體檢測陽性207例(71.4%)。兩種檢測方法檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。<1歲復診患兒核酸檢測陽性2例(0.69%)，抗體檢測陽性23例(7.93%)，兩種檢測方法檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；1～5歲復診患兒兩種檢測方法檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；5歲以上復診患兒兩種檢測方法檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同年齡復診患兒兩種檢測方法結果比較(n)

2.3初診與復診患兒兩種檢測方法檢出率的差異 初診患兒的核酸檢測陽性率為33.8%，復診患兒的核酸檢測陽性率為16.9%，不同病程時期核酸檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。初診患兒的抗體檢測陽性率為84.5%，復診患兒的抗體檢測陽性率為82.8%，不同病程時期血清學抗體檢出率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3～4。

表3 初診與復診患兒的核酸檢測結果比較(n)

表4 初診與復診患兒的血清學抗體檢測結果比較(n)

3 討 論

手足口病發(fā)病率為37/100 000～205/100 000，病死率也較高，且近年來其發(fā)病率有逐年增長的趨勢。手足口病能通過糞口途徑、呼吸道飛沫、接觸途徑傳播[5-6]。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20余種，以EV71和CA16最為常見，EV71感染更被認為是導致手足口病患兒死亡的最主要原因，其傳染性較強，能在短時間內(nèi)造成較大范圍的流行[7-8]，嚴重威脅兒童的生命健康。

采用膠體金法進行血清學抗體檢測，具有操作簡便易行、標本可批量處理等優(yōu)點，在臨床上應用較為廣泛，但其缺點在于檢測過程中會因存在抗體交叉反應而出現(xiàn)較高的假陽性率，也可能受膠體金硝酸纖維素膜檢測線上包被的抗原種類限制以及體內(nèi)抗體滴度因素影響而出現(xiàn)假陰性。而SAT的優(yōu)點為檢測快速敏感，可早期診斷，并且可同時檢測EV71、CA16和腸道病毒通用型，對手足口病腸道病毒病原體各種常見亞型實現(xiàn)全覆蓋，是目前臨床實驗室的主要檢測方法[9-10]。本研究對比兩種檢測方法的檢出率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且病毒血清學抗體檢出率顯著高于腸道病毒核酸，二者吻合度和一致性不高。造成該現(xiàn)象的可能原因有以下3點：(1)患兒感染后血清抗體為非特異性的。(2)患兒感染其他亞型腸道病毒后，抗體在體內(nèi)存在時間較長，會對結果造成影響。(3)膠體金法假陽性率較高。在進行血清學抗體檢測時，兩種病毒血清學抗體初診檢出情況為CA16陽性183例，EV71陽性153例，2周復診時，CA16陽性207例,EV71陽性177例，復診陽性數(shù)均高于初診。一方面反映出抗體在體內(nèi)持續(xù)時間長，另一方面也提示初、復診均有部分標本出現(xiàn)了EV71-IgM和CA16-IgM雙抗體陽性結果。這是由于EV71與CA16基因水平的同源性為77%，而氨基酸水平的同源性為86%[3,5]，因此筆者認為此類標本需要核實核酸檢測結果，才能明確具體病原體，以及是否為合并感染。由于實驗室檢查的局限性和研究設計上的缺陷，本研究未對該類標本檢測結果進行鑒別。兩次檢測結果提示，病毒血清學抗體在體內(nèi)持續(xù)時間更長，提示病毒血清學抗體檢測不利于判斷疾病恢復期病毒復制情況，也不利于判斷是否需要延長隔離時間。

考慮到不同病程、不同標本采集方法、病毒復制、排毒周期以及個體免疫差異等因素，單一的檢測方法均存在一定的局限性和漏檢情況。因此，在患兒患病早期或者免疫功能比較低下時，采用核酸與抗體聯(lián)合檢測的方式有助于提高早期檢出率[7,11]，最終實現(xiàn)預防感染和控制疾病流行的目的，為患兒的后續(xù)治療提供可靠依據(jù)。

重癥患兒癥狀緩解出院后或多數(shù)患兒在起病2周后，臨床癥狀已經(jīng)消失，但仍有部分患兒存在排毒的情況，提示有癥狀的患兒和無癥狀的康復期患兒均可能成為傳染源[12-14]，導致所在社區(qū)、學校的手足口病傳播與流行。因此，明確手足口病患兒的排毒時間，對防治手足口病具有重要意義。由于核酸檢測可以更加準確地判斷疾病恢復情況，因此建議在恢復期進行病毒的核酸檢測，有助于該病的防控工作。

4 結 論

EV71與CA16核酸與抗體檢測結果的一致性不高?？贵w檢測存在交叉反應陽性。核酸檢測有助于了解患兒恢復期病毒復制情況，對確定手足口病患兒在病程2周后是否仍需要延長隔離時間以及準確制訂隔離期具有較大意義。核酸與抗體聯(lián)合檢測可一定程度上避免單一方法檢測的局限性，有助于提高早期檢出率，為患兒的后續(xù)治療提供可靠依據(jù)。