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    巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌的生長預(yù)測模型構(gòu)建

    2020-07-28 02:15:10孟司奇丁高藍(lán)肖興寧肖英平
    關(guān)鍵詞:腸毒素平方根巴氏

    孟司奇,丁高藍(lán),肖興寧,肖英平,楊 華,汪 雯

    (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所,農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌),浙江 杭州 310021)

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是革蘭氏陽性菌,廣泛分布于牛奶、肉類、蛋類等食物中,是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),2018年,上海市生鮮肉中金黃色葡萄球菌的檢出率為32.9%[2];我國生牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率則為15%~38%[3]。對我國2003—2015年學(xué)校食源性疾病發(fā)生趨勢的分析表明,金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒人數(shù)排名前5,對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了較大威脅[4]。金黃色葡萄球菌腸毒素是一種細(xì)菌外毒素,對高溫、低pH環(huán)境具有較強(qiáng)耐受性,危害性更大。據(jù)統(tǒng)計(jì),有50%~75%的金黃色葡萄球菌在合適的條件下能產(chǎn)生腸毒素[5-6]。美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)報(bào)告顯示,金黃色葡萄球菌腸毒素已成為世界性的食品安全問題[7]。

    巴氏殺菌乳是生乳在低于100 ℃的溫度下處理適當(dāng)時間殺死部分致病菌制得的液態(tài)乳,與超高溫滅菌乳相比,巴氏殺菌后乳品中的營養(yǎng)價值保存較好。這是巴氏殺菌乳在國外乳品市場占有率高的原因之一[8-9]。乳制品在原料收集、加工、儲藏的過程中往往會受到金黃色葡萄球菌的污染[10],但是巴氏殺菌的工藝特點(diǎn)決定其并不能殺滅所有微生物,如果儲藏溫度適合,巴氏殺菌乳將成為金黃色葡萄球菌生長的良好培養(yǎng)基[11]。據(jù)2017年對我國市售巴氏殺菌乳微生物污染的調(diào)查,散裝巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌檢出率為2.65%[12]。研究表明,當(dāng)巴氏殺菌乳中的金黃色葡萄球菌含量達(dá)到105~107CFU·mL-1,即可產(chǎn)生足量的腸毒素造成人體中毒[13]。因此,研究金黃色葡萄球菌在巴氏殺菌乳中的生長情況對于保障乳品,乃至食品安全來說都具有積極意義。

    預(yù)測微生物學(xué)利用數(shù)學(xué)模型定量分析食品中病原菌和腐敗菌的生長和存活狀況,評價環(huán)境因子對食品質(zhì)量安全的影響,從而對貨架期做出合理預(yù)測,旨在提高衛(wèi)生檢驗(yàn)效率,保障食品安全[14-15]。本實(shí)驗(yàn)以巴氏殺菌乳為原料,分別測定在4、10、16、20、24、28 ℃儲藏條件下金黃色葡萄球菌含量的變化,分別采用Modified Gompertz模型、Huang模型、Logistic模型和Baranyi模型構(gòu)建恒定溫度下巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌的生長動力學(xué)一級模型,另建立二級模型以描述溫度與最大生長速率(μmax)的關(guān)系,并通過外部驗(yàn)證方法檢驗(yàn)預(yù)測模型的準(zhǔn)確性。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    材料:金黃色葡萄球菌菌株(ATCC 25923);市售巴氏殺菌乳。

    試劑:Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、卵黃亞碲酸鉀增菌劑,北京路橋技術(shù)股份有限公司;腦心浸出液(BHI)、緩沖蛋白胨水(BPW),美國BD公司;NaCl(分析純),廣東光華科技股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    KB240恒溫恒濕培養(yǎng)箱,德國Binder公司;SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;HVA-85高壓蒸汽滅菌鍋,日本Hirayama株式會社;WB04XL螺旋涂布儀,英國Don Whitley Scientific公司;ProtoCOL P3/1513 菌落計(jì)數(shù)儀,英國Synbiosis公司;1300 series A2生物安全柜,美國Thermo公司。

    1.3 恒定溫度下金黃色葡萄球菌的生長曲線測定

    1.3.1 菌液制備

    取超低溫保存的金黃色葡萄球菌菌株,常溫化凍,使用移液槍吸取0.1 mL添加到5 mL含7%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl的BHI中,37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌株復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌株充分搖勻,得到菌含量約為108CFU·mL-1的菌懸液,用BPW稀釋到105CFU·mL-1備用。

    1.3.2 金黃色葡萄球菌的接種、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

    在巴氏殺菌乳中添加菌懸液,制備菌含量約為103CFU·mL-1的初始污染試樣。將試樣充分搖勻后,分別放置在4、10、16、20、24、28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),根據(jù)不同溫度下的生長速率設(shè)定相應(yīng)的取樣時間,將取出的樣品用BPW進(jìn)行適當(dāng)稀釋,利用螺旋涂布儀進(jìn)行平板涂布,放置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,然后用平板計(jì)數(shù)儀對菌量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

    1.3.3 一級模型擬合

    一級模型主要描述微生物數(shù)量與時間的關(guān)系。本研究利用OriginPro 9.0軟件,分別采用Modified Gompertz模型、Huang模型、Logistic模型和Baranyi模型進(jìn)行巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌在恒定溫度下的生長曲線擬合[16-19],建立特定溫度下金黃色葡萄球菌隨時間變化的一級生長模型,獲得相對最大生長速率(μmax)。

    Modified Gompertz模型方程為

    (1)

    Huang模型方程為

    lgNt=lgN0+lgNmax-lg{exp(lgN0)+[exp(lgNmax)-exp(lgN0)]*exp[-μmax*(B)]},

    (2)

    (3)

    式(1)~(3)中:Nt為t時刻的菌落數(shù)(CFU·mL-1),N0為初始菌落數(shù)(CFU·mL-1),Nmax為最大菌落數(shù)(CFU·mL-1),μmax為相對最大生長速率(h-1),λ為菌生長遲滯期(h)。

    Logistic模型方程為

    (4)

    式(4)中:t0為細(xì)菌生長速率最大時所對應(yīng)的時間(h),p為t0時的相對生長速率(斜率,h-1)。

    Baranyi模型方程為

    (5)

    (6)

    式(6)中h0為微生物初始生理狀態(tài)。

    1.3.4 二級模型擬合

    引入二級模型描述溫度對初級模型參數(shù)的影響。本研究采用平方根模型和Arrhenius模型擬合溫度-相對最大生長速率(μmax)曲線[20-21]。

    平方根模型方程為

    (7)

    式(7)中:b為系數(shù);T為培養(yǎng)溫度(℃);Tmin為最低生長溫度(℃),指微生物沒有代謝活動時的溫度,是通過外推回歸線與溫度軸相交而得到的溫度。

    Arrhenius模型方程為

    (8)

    式(8)中:a為頻率因子;T為溫度(℃);R為氣體常數(shù),8.314 J·mol-1·℃-1;ΔG′為吉布斯自由能(J·mol-1);n為指數(shù)系數(shù)。

    1.3.5 模型的評價和驗(yàn)證

    利用決定系數(shù)(R2)、均方根誤差(RMSE)和赤池信息準(zhǔn)則數(shù)值(AIC,衡量統(tǒng)計(jì)模型擬合優(yōu)良性的一種標(biāo)準(zhǔn),值越小越好)評價一級模型的擬合程度;利用R2、RMSE評價二級模型,并采用準(zhǔn)確因子(Af)和偏差因子(Bf)驗(yàn)證準(zhǔn)確度。

    Af和Bf是驗(yàn)證模型可靠度的有效工具[22]。Af可以衡量預(yù)測值和觀測值的接近程度。一般認(rèn)為,Af值越接近于1,表明模型平均精確度越高,Af值介于1.1~1.9的模型也可接受[23-24]。Bf可以衡量預(yù)測值的偏離程度。一般認(rèn)為,Bf值越接近于1越可靠,在0.90~1.05的表現(xiàn)良好,在0.70~0.90或1.05~1.15的也可接受[25-26]。本研究采用ComBase模型[27]和文獻(xiàn)[28-32]中金黃色葡萄球菌在巴氏殺菌乳或生鮮乳等原料中的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行外部驗(yàn)證,計(jì)算Af和Bf。

    (9)

    (10)

    式(9)、(10)中:pre為預(yù)測值,obs為實(shí)測值,n為測量值個數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 一級模型建立

    結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和圖1可知,4 ℃下巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的對數(shù)值在0~216 h下降了0.2個單位[lg(CFU·mL-1)],金黃色葡萄球菌處于緩慢失活的過程。采用OriginPro 9.0軟件,分別利用Modified Gompertz模型、Huang模型、Logistic模型和Baranyi模型對10、16、20、24、28 ℃下巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合(圖2),并由此得到相應(yīng)的模型參數(shù)(表1~4)。由表1可知,各溫度下巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的對數(shù)值均隨時間推進(jìn)而呈上升趨勢,并且隨著溫度升高,相對最大生長速率(μmax)不斷升高,遲滯期(λ)不斷下降,說明金黃色葡萄球菌的生長狀況與溫度密切相關(guān)。

    圖1 巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌在4 ℃的衰亡趨勢Fig.1 Survival trend of S. aureus in pasteurized milk at 4 ℃

    由表1~4可知,10~28 ℃下4種模型的決定系數(shù)(R2)均大于0.97;Huang模型與其他3種模型相比,AIC值較高,且在16 ℃下R2較低(0.97);Logistic模型的p值與Baranyi模型的μmax值均在16 ℃最高,然后隨溫度升高呈下降趨勢,與實(shí)際情況不符,只有Modified Gompertz模型的μmax值與溫度呈正相關(guān)關(guān)系。綜上,本研究選用Modified Gompertz模型為最終的一級模型。

    表1 Modified Gompertz模型擬合得到的生長參數(shù)和擬合參數(shù)

    2.2 二級模型建立

    一級模型主要描述微生物數(shù)量與時間的定量關(guān)系,無法表達(dá)環(huán)境因素對微生物生長的影響。本研究主要考慮溫度對生長參數(shù)的作用,利用平方根模型和Arrhenius模型作為二級模型,根據(jù)Modified Gompertz模型擬合得到的巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌在不同溫度下生長的μmax,采用OriginPro 9.0軟件對溫度與μmax的關(guān)系進(jìn)行擬合(圖3)。

    表2 Huang模型擬合得到的生長參數(shù)和擬合參數(shù)

    表3 Logistic模型擬合得到的生長參數(shù)和擬合參數(shù)

    表4 Baranyi模型擬合得到的生長參數(shù)和擬合參數(shù)

    由圖3可見,Arrhenius模型的R2為0.99,而平方根模型的R2為0.90,說明Arrhenius模型的擬合度更高;因此Arrhenius模型較平方根模型能更好地描述本研究中10~28 ℃范圍內(nèi)巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌相對最大生長速率與溫度的關(guān)系。

    圖3 Arrhenius模型(A)和平方根模型(B)擬合的μmax與生長溫度的關(guān)系曲線Fig.3 Fitted relationship of maximum growth rates of S .aureus with temperatures by Arrhenius model (A) and square root model (B),respectively

    2.3 模型評價與驗(yàn)證

    預(yù)測模型構(gòu)建后,不僅要對其擬合度進(jìn)行評估,還要在應(yīng)用之前經(jīng)過驗(yàn)證來對模型的可靠性做出評價。本研究利用外部驗(yàn)證對建立的二級模型進(jìn)行驗(yàn)證。

    由表5可知,相較于平方根模型,Arrhenius模型的R2(0.99)更高,RMSE值(0.60)更低,說明Arrhenius模型的擬合程度高,離散程度低。Arrhenius模型的Af值為1.39,Bf值為0.87;平方根模型的Af值為1.57,Bf值為0.83。兩種模型的Af值和Bf值均在合理范圍內(nèi),但前者更接近于1。綜上,Arrhenius模型的預(yù)測效果更好。

    表5 二級模型的Af、Bf、RMSE和R2

    在本研究檢索范圍內(nèi),關(guān)于巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌生長預(yù)測模型的文獻(xiàn)研究較少,所以本研究結(jié)合了金黃色葡萄球菌在生鮮乳、滅菌乳等產(chǎn)品中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型的外部驗(yàn)證,不同來源的數(shù)據(jù)偏差較大,致使Af值偏大,但也體現(xiàn)了模型的普適性。

    3 討論

    預(yù)測微生物學(xué)通過數(shù)學(xué)模型對特定環(huán)境下微生物的數(shù)量變化進(jìn)行預(yù)測。目前,已有許多學(xué)者就乳品中微生物的預(yù)測模型進(jìn)行了研究。魏釗異等[33]利用Ratkowsky平方根模型描述了溫度對巴氏殺菌乳中微生物菌群生長的影響,所建模型能有效預(yù)測菌落總數(shù)的動態(tài)變化;趙鑫等[34]將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型與Gompertz模型相比較,建立了以溫度為自變量的平方根模型;Fujikawa等[35]構(gòu)建了14.0~36.5 ℃下金黃色葡萄球菌在滅菌乳中的生長模型和產(chǎn)腸毒素模型,認(rèn)為腸毒素產(chǎn)生速率與溫度呈線性關(guān)系,為控制滅菌乳中的金黃色葡萄球菌及其腸毒素供了科學(xué)數(shù)據(jù),但因?yàn)榘褪蠚⒕楠?dú)特的工藝,導(dǎo)致基于滅菌乳建立的模型在巴氏殺菌乳中適用性并不高。本文描述了巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌的生長動態(tài)規(guī)律,可以為巴氏殺菌乳的定量風(fēng)險(xiǎn)評估提供幫助。

    現(xiàn)有的定量風(fēng)險(xiǎn)評估通常使用105CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌作為產(chǎn)生足量腸毒素并導(dǎo)致食物中毒的閾值[36]。當(dāng)巴氏殺菌乳中的金黃色葡萄球菌的初始含量為103CFU·mL-1時,在10 ℃下約需130 h其含量即可達(dá)到105CFU·mL-1,在16 ℃下這一過程約需28 h,而在20、24、28 ℃下則僅需17~19 h。所以,當(dāng)儲藏溫度為28 ℃時,雖然20 h以內(nèi)巴氏殺菌乳的感官品質(zhì)不會發(fā)生明顯變化,但是卻會給人體健康埋下較大隱患。因此,在巴氏殺菌乳的運(yùn)輸、銷售和存儲過程中,均應(yīng)嚴(yán)格控制存放溫度和時間。

    多項(xiàng)研究報(bào)道,金黃色葡萄球菌腸毒素的產(chǎn)生除了受金黃色葡萄球菌濃度的影響外,還受到外部環(huán)境和自身的綜合影響。這就導(dǎo)致學(xué)界一直以來都未能建立準(zhǔn)確的劑量-反應(yīng)模型。因此,目前基于金黃色葡萄球菌數(shù)量進(jìn)行的安全性評價仍具有一定的局限性[37-38]。未來,可在巴氏殺菌乳中結(jié)合更多環(huán)境因素的影響建立金黃色葡萄球菌和腸毒素預(yù)測模型,確立二者的定量關(guān)系,為巴氏殺菌乳的風(fēng)險(xiǎn)評估提供全面、高效的信息。

    綜上,本文研究了4~28 ℃范圍內(nèi)金黃色葡萄球菌在巴氏殺菌乳中的生長規(guī)律,建立了巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌生長的一級模型和二級模型。綜合比較了4種一級模型的效果,發(fā)現(xiàn)Modified Gompertz模型在不同溫度下擬合度均較好,是描述巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌生長規(guī)律的最適一級模型。對比平方根模型,Arrhenius模型的R2和RMSE值分別為0.99和0.60,可作為二級模型擬合相對最大生長速率與溫度間的關(guān)系。外部驗(yàn)證結(jié)果表明,Af值和Bf值均在可接受范圍內(nèi),說明本實(shí)驗(yàn)所建立的二級模型能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌的生長狀況,模型具有可靠性。本研究可為巴氏殺菌乳中金黃色葡萄球菌的安全性評價、乳品貨架安全期預(yù)測,以及乳品乃至食品中致病微生物的定量研究提供依據(jù)。

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