侵染狄斯瓦螨后西方蜜蜂的致畸等級(jí)劃分

胡宗文，楊 娟，苗春輝，黃新球，楊 爽

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 草壩661101)

當(dāng)?shù)宜雇唑?Varroadestructor)侵染西方蜜蜂蜂群后，蜜蜂的免疫受到了抑制[1]，同時(shí)蜂螨的寄生能引發(fā)宿主蜜蜂長(zhǎng)期的隱性病毒感染[2]，誘發(fā)了蜂群和蜜蜂個(gè)體復(fù)雜而又高度多變的病征，即蜂螨綜合征(parasite mite syndrome)[3]。研究表明，在蜂群崩潰時(shí)，蜂群中大量的病原體與相關(guān)因素的應(yīng)答反應(yīng)異常[4]，而狄斯瓦螨是主要的激活因子[5-8]。狄斯瓦螨侵染西方蜜蜂后，探索個(gè)體蜜蜂呈現(xiàn)出體型不正常的形態(tài)機(jī)理對(duì)理解蜜蜂病態(tài)發(fā)育有重要意義，也能為控制蜜蜂疾病的發(fā)生提供新的途徑。

狄斯瓦螨對(duì)蜜蜂個(gè)體的行為和健康有直接影響[9]，如吸取蜜蜂血淋巴，導(dǎo)致蜜蜂發(fā)育時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重的營養(yǎng)不良，并能改變蜜蜂的生理功能和產(chǎn)生二次感染[6]，隨之蜜蜂體質(zhì)量減輕、形態(tài)畸形、爬行蜂的出現(xiàn)、翅膀卷曲、幼蟲和蜂蛹大量死亡、成年蜂壽命縮短[5，10]，導(dǎo)致采集力下降、蜂群勢(shì)迅速削弱、失去生產(chǎn)能力等。工蜂的翅膀卷曲是狄斯瓦螨侵襲后的典型癥狀，大量研究表明，卷翅病毒是造成蜜蜂殘翅的主要原因[8，11-12]，與歐洲地區(qū)蜂群越冬時(shí)蜂群崩潰失調(diào)有顯著的線性關(guān)系[13-14]。然而，對(duì)于狄斯瓦螨侵襲蜂群后工蜂出現(xiàn)的致畸性等級(jí)的評(píng)價(jià)與劃分還未見報(bào)道。并且蜜蜂的體型、體態(tài)可以以形態(tài)測(cè)定數(shù)據(jù)反映出其中的差異[15]。因此，本研究擬以狄斯瓦螨侵襲西方蜜蜂群為研究對(duì)象，以形態(tài)學(xué)手段測(cè)定狄斯瓦螨對(duì)西方蜜蜂的致畸等級(jí)，揭示寄生—宿主間的系統(tǒng)進(jìn)化有重要意義，為探明蜂螨侵入西方蜜蜂蜂群后引起蜜蜂個(gè)體病理性變化具有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

蜂群：6群西方蜜蜂群，飼養(yǎng)于國家蜂產(chǎn)業(yè)體系紅河試驗(yàn)站西方蜜蜂場(chǎng)，供觀察的蜂群遺傳背景清晰。

形態(tài)測(cè)定測(cè)定工具：鑷子、昆蟲針、手術(shù)剪、75%乙醇、3 mL離心管、透明膠片、品紅、微小形態(tài)測(cè)定儀、bee2軟件。

1.2 方法

1.2.1 供試蜂群的處理

在試驗(yàn)開始前將試驗(yàn)蜂群統(tǒng)一更換成產(chǎn)卵性狀良好的新王，治螨越冬，來年3月初進(jìn)行扣王治螨，并輔助使用升華硫、甲酸、螨撲等徹底治螨，保證狄斯瓦螨有極低的感染率，從而為試驗(yàn)獲得大量未感染蜂群及幼蟲。相反，螨害群為終年不治螨，一年后即能獲得足夠量的狄斯瓦螨。當(dāng)不治螨的蜂群出現(xiàn)大量翅膀異常工蜂時(shí)可采樣進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 取樣及樣品描述

在蜂群感染蜂螨數(shù)周后，工蜂出現(xiàn)了表1的4種類型工蜂，根據(jù)表1的描述對(duì)兩種蜂群進(jìn)行取樣，每種體型的樣品各30只，置于75%乙醇內(nèi)，-4 ℃儲(chǔ)存。

表1 樣品描述

1.2.3 樣品解剖與形態(tài)測(cè)定

參照1988年Ruttner[15]提出的形態(tài)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，在立體顯微鏡下解剖出蜜蜂的喙、右前翅、右后翅、第三、四背板、第三、六腹板、右后足后制作膠片，在電腦—形態(tài)成像儀下拍照測(cè)定38個(gè)形態(tài)特征值。測(cè)定的形態(tài)特征值及中英文對(duì)照見表2。

表2 蜜蜂形態(tài)指標(biāo)

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

將軟件Bee2生成的各種形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)在Excel統(tǒng)計(jì)，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0 分析和處理，并進(jìn)行因素分析和聚類分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。因素分析可揭示不同體型工蜂的形態(tài)特征及它們之間的相互關(guān)系，以獲得蜂群感染蜂螨后工蜂的畸形等級(jí)，聚類分析是為了進(jìn)一步證實(shí)因素分析得到的結(jié)論，測(cè)定不同的樣本相互之間的形態(tài)學(xué)關(guān)系及其形態(tài)學(xué)距離并進(jìn)行相關(guān)分析，以做出蜂螨致畸性的等級(jí)評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種類型西方蜜蜂工蜂的形態(tài)特征值

對(duì)各體型工蜂形態(tài)測(cè)定，圖1顯示了不同體型工蜂的形態(tài)特征值存在著差異。對(duì)于喙來說，巢內(nèi)正常蜂>畸形蜂>采集蜂>爬行蜂，ANOVA檢驗(yàn)結(jié)果為F(3，78)=26.997，P<0.01，差異極顯著。腿部特征(圖1-A)主要體現(xiàn)在跗節(jié)花粉筐的大小，它是評(píng)價(jià)蜜蜂攜帶花粉量的重要指標(biāo)，形態(tài)特征值顯示，畸形蜂的腿部特征值均小于其他3種體型的工蜂：腿長(zhǎng)(8.188±0.122)mm、跗節(jié)寬(1.181±0.236)mm差異極顯著(P<0.01)，但跗節(jié)長(zhǎng)(2.111±0.415)mm、脛節(jié)長(zhǎng)(3.223±0.525)mm、股長(zhǎng)(2.854±0.501)mm差異不顯著，ANOVA檢驗(yàn)結(jié)果為F(3，78)=1.016，P=0.39。背部特征值(圖1-B)主要體現(xiàn)在背部體節(jié)的大小，畸形蜂的LT3(F(3，78)=0.469，P=0.705)、LT4(F(3，78)=1.480，P=0.226)、LT3+4(F(3，78)=1.143，P=0.337)高于其他3種蜂，差異均不顯著。腹部(圖1-C)特征值是泌蠟?zāi)芰Φ捏w現(xiàn)，第六腹板S6包裹著毒囊，一定程度上也反映出蜜蜂毒囊的大小，蠟鏡面積為爬行蜂(3.072 mm2)>巢內(nèi)正常蜂(2.968 mm2)>采集蜂(2.573 mm2)>畸形蜂(2.451 mm2)，F(xiàn)(3，78)=3.019，P=0.035，組間差異顯著。形態(tài)指數(shù)是評(píng)價(jià)蜜蜂形態(tài)特征的參數(shù)，反映出蜜蜂體型的完整程度，從圖1-D來看，畸形蜂翅脈指數(shù)為-0.501，翅膀變異程度最大；爬行蜂第六腹板寬指數(shù)(ST6W)最大為93.686，而背腿比最小56.759，從形態(tài)結(jié)構(gòu)上來說背部與腿部的比例失調(diào)可能是造成爬行蜂的重要原因之一。

2.2 不同體型工蜂的翅膀測(cè)定值的線性關(guān)系

對(duì)不同體型的工蜂進(jìn)行翅膀上的形態(tài)測(cè)定，如圖2所示。翅長(zhǎng)(LFW)、翅寬(WFW)、翅脈指數(shù)(CubI)、翅鉤(Hooks)及翅寬指數(shù)(FWW)相互間沒有顯著的線性相關(guān)性，但畸形蜂與其他3種蜂分離開，表明畸形蜂在形態(tài)上與其他體型工蜂有著顯著的差異。

圖2 工蜂翅膀5個(gè)形態(tài)特征值的矩陣散點(diǎn)圖Fig.2 Five morphologic indexes matrix scatter plot of worker bees

2.3 各種體型蜜蜂的主成分分析

沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars without the same letters showed significant difference (P<0.05).圖1 不同類型工蜂的形態(tài)特征值Fig.1 The morphologic feature value of worker bees

通過對(duì)各類體型蜜蜂的主成分分析，由表3可見：第1特征值的貢獻(xiàn)率為44.5%，第2-8特征值的貢獻(xiàn)率分別為11.029%、9.398%、7.599%、5.836%、4.125%、3.109%、2.777%。按照累積貢獻(xiàn)率超過85%，信息損失量低于15%的選擇原則，我們選取了前8個(gè)特征值，定義為第1、2、3、4、5、6、7、8主成分。

表3 相關(guān)矩陣特征值與累積貢獻(xiàn)率

通過主成分分析后，我們確定了蜂螨侵染蜂群后影響西方蜜蜂工蜂形態(tài)特征的8個(gè)主要成分，見表4，它反映了主成分結(jié)合的變異信息，體現(xiàn)在蜜蜂的體型的變異程度，表中數(shù)字即為各因子的系數(shù)，可用如下數(shù)學(xué)式表達(dá)：

表4 八個(gè)主成分的特征向量

F1=0.981X1-0.018X2-0.097X3+0.148X4+0.068X5-0.03X6-0.014X7+0.011X8；

F2=0.118X1+0.744X2+0.219X3-0.518X4-0.129X5-0.230X6+0.080X7-0.203X8；

F3=0.082X1-0.123X2+0.89X3-0.008X4+0.193X5+0.357X6-0.144X7-0.004X8；

F4=-0.110X1+0.566X2-0.098X3+0.624X4+0.383X5+0.256X6-0.034X7-0.236X8；

F5=-0.037X1-0.065X2+0.361X3+0.518X4-0.317X5-0.655X6+0.194X7-0.170X8；

F6=0.040X1+0.207X2+0.009X3+0.209X4-0.803X5+0.461X6-0.052X7+0.230X8；

F7=-0.039X1+0.238X2+0.063X3+0.093X4+0.150X5-0.322X6-0.461X7+0.769X8；

F8=0.005X1+0.089X2+0.077X3+0.02X4+0.166X5+0.095X6+0.848X7+0.480X8。

F表示主成分，X1-X8代表8項(xiàng)特征值指標(biāo)。

2.4 各類體型工蜂的因素分析

結(jié)合表4中的結(jié)果，對(duì)不同體表工蜂的主成分?jǐn)?shù)據(jù)處以區(qū)辨分析，所得結(jié)果見圖3，體表畸形的大部分工蜂都靠近因素2，僅有一只工蜂接近因素1，而巢內(nèi)正常蜂、爬行蜂、采集蜂遠(yuǎn)離因素1、2。因素1主要跟蜜蜂的翅膀，如翅脈角、長(zhǎng)寬等相關(guān)，因素2定義了蜜蜂腹部的特征值，離得越近說明殘缺或畸形程度越高，這與圖1、2和表3中的結(jié)果相符，說明在狄斯瓦螨侵襲蜂群后對(duì)西方蜜蜂工蜂的翅膀、腹部作用最為明顯，即翅膀與腹部的脆弱性易在蜂螨入侵后首先發(fā)生變化。

圖3 各類體型工蜂的區(qū)辨分析圖Fig.3 Discriminated analysis for worker bees

2.5 各類體型工蜂的聚類分析

圖4表明，將4種類型的工蜂進(jìn)行形態(tài)測(cè)定后進(jìn)行聚類分析，從距離Distance由遠(yuǎn)及近來看，在Distance20-25中間出現(xiàn)了第一級(jí)別的分支，此時(shí)畸形蜂中43#蜜蜂獨(dú)立出來，表明此蜜蜂體型與其他工蜂有著極大差異。在Distance10附近分出第二級(jí)別，此時(shí)大部分的畸形蜂作為一個(gè)分支，少數(shù)的體型略為完整的工蜂分散于其他3種體型的工蜂中。爬行蜂在形態(tài)測(cè)定中不能與巢內(nèi)正常蜂、采集蜂等正常的工蜂區(qū)分開。

Num為單只蜜蜂樣本編號(hào)。Sample為樣品分類，其中1為巢內(nèi)正常蜂，2為畸形蜂，3為爬行蜂，4為采集蜂。Num represented the number of single bee sample. Sample showed the cluster of bee，among which 1was normal bee，2 was deformed bee，3 was climbing bee，4 was forager.圖4 各類體型工蜂的聚類分析Fig.4 The cluster analysis of worker bees

2.6 畸形蜂的畸形等級(jí)劃分

在對(duì)肉眼可見的體型異常的蜜蜂進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)定，如圖5，score1與翅膀相關(guān)，score2與腹部相關(guān)，數(shù)值正向越大表示越完整，在狄斯瓦螨侵染后西方蜜蜂形成的畸形蜂可分為3個(gè)等級(jí)：A型體型趨于正常工蜂，如35#、38#，翅膀、腿、腹部基本完整，能夠清晰地測(cè)定到翅脈角、翅脈指數(shù)以及腿、腹部的參數(shù)，屬于輕微的畸形。B型蜜蜂屬于中度畸形，表現(xiàn)為翅膀完全殘缺，腹部相對(duì)完整，大部分的被蜂螨侵染后的工蜂都呈現(xiàn)出這種體型。C型屬于重度殘缺，如43#工蜂，表現(xiàn)為翅膀、腹、腿的畸形，在蜂群里的出現(xiàn)比例較低。為了更直觀地比較各種體型的工蜂，我們進(jìn)行了聚類分析比較，如圖6。

圖5 畸形蜂的區(qū)辨分析圖Fig.5 Discriminated analysis for deformed bees

從圖6可以看出，在聚類分析后蜂螨致使西方蜜蜂的畸形等級(jí)在大的方面可分為3個(gè)等級(jí)，與圖4、5結(jié)果相似，但對(duì)于翅膀畸形的B型蜜蜂又進(jìn)一步劃分出了3個(gè)小的等級(jí)，分別為31和36號(hào)為第一支，表現(xiàn)為腿部結(jié)構(gòu)相近；37號(hào)為第二支，表現(xiàn)為前翅殘缺，后翅能模糊看到翅鉤；32、33、34號(hào)和41、42、40號(hào)及39號(hào)共同組成了第三支。結(jié)合各自的形態(tài)數(shù)據(jù)來看，蜂螨侵襲蜂群后造成翅膀上出現(xiàn)的差異是劃分西方蜜蜂工蜂畸形等級(jí)的依據(jù)所在。

圖6 畸形蜂的聚類分析Fig.6 The cluster analysis of malformed bees

3 討論

細(xì)胞或者機(jī)體的畸形變異是一個(gè)漸進(jìn)的過程，也是內(nèi)部有害物質(zhì)累積的過程[16]。體內(nèi)有害物質(zhì)積累到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)錯(cuò)誤、染色體畸形，引起系統(tǒng)功能紊亂，最終導(dǎo)致機(jī)體死亡[17]。狄斯瓦螨是一種體表寄生性害螨，通過刺吸式吸食蜜蜂成蜂和幼蟲的血淋巴，同時(shí)向蜜蜂體內(nèi)輸入多種病毒和致病菌，伴隨著狄斯瓦螨不斷的繁殖[18]，體內(nèi)的有害物質(zhì)累積而呈現(xiàn)出顯性感染狀態(tài)，抑制蜜蜂的免疫力，造成蜜蜂畸形，67 h后多數(shù)蜜蜂死亡。在本次試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)畸形蜂的腿部特征值均小于其他3種體型的工蜂(圖1)，T3+4顯著長(zhǎng)于其他3種蜂，并且Ci指數(shù)為負(fù)，說明在狄斯瓦螨侵染蜂群后，螨蟲注入蜜蜂體內(nèi)的病原體能夠重塑蜜蜂的外表。

形態(tài)學(xué)手段是明確蜜蜂體型特征值的重要手段，1988年Ruttner[15]系統(tǒng)闡述了蜜蜂軀體的形態(tài)指標(biāo)及測(cè)定方法，成為研究蜜蜂體型、體色差異的重要手段。研究表明，蜜蜂形態(tài)學(xué)測(cè)定用于區(qū)辨蜜蜂的地理分布[19]、溫濕度[19]、營養(yǎng)[21]對(duì)蜜蜂發(fā)育的影響、蜂種鑒定[22]等。在本次研究中，采取日齡基本相同的三種類型工蜂對(duì)比成熟采集蜂，以形態(tài)學(xué)手段分析西方蜜蜂群在侵染狄斯瓦螨后，探明工蜂體型出現(xiàn)差異程度是接近同日齡段還是更接近老年蜂，在一定程度上擴(kuò)展了形態(tài)測(cè)定的運(yùn)用。

普遍認(rèn)為狄斯瓦螨是以吸食蜜蜂血淋巴，并以血淋巴為途徑將致病的病原體傳遞到蜜蜂全身[23-24]，進(jìn)而致使工蜂出現(xiàn)體表異常。然而，Ramsey等[25]通過對(duì)比熒光印記及電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)瓦螨取食蜜蜂的脂肪體而非血淋巴，并且在取食蜜蜂的脂肪體后瓦螨能產(chǎn)更多卵，成活更久，通過脂肪體影響蜜蜂的健康。在我們的研究中也有相似發(fā)現(xiàn)，螨害嚴(yán)重時(shí)工蜂的腹部畸形缺失，而這一部位聚集了大量的脂肪體，脂肪體的缺失造成蜜蜂更嚴(yán)重的影響。

在植物體內(nèi)，多種關(guān)鍵的表觀遺傳基因的突變可引起植物的多效性表型，如延遲或加速花卉變換、形態(tài)轉(zhuǎn)變、生物的或非生物的異常脅迫應(yīng)答、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)等[26]。相關(guān)證據(jù)顯示，已確認(rèn)的數(shù)種蜜蜂畸翅病毒和急性蜜蜂麻痹病毒的變異體是整體蜂群崩潰的致命病因[2，27]，而蜂螨侵襲蜂群后蜜蜂DNA甲基化水平的變化及其對(duì)蜜蜂健康的影響尚不清楚[28]，但從形態(tài)結(jié)構(gòu)上來說背部與腿部的比例失調(diào)或許是DNA甲基化表現(xiàn)的一種結(jié)果。

長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，生物體演變出了一套成熟的DNA損傷檢測(cè)體系，及針對(duì)不同損傷類型的DNA修復(fù)模式，以便維持遺傳信息的完整性和穩(wěn)定性。若正確修復(fù)，細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)和功能即能恢復(fù)正常，細(xì)胞繼續(xù)維持正常的穩(wěn)態(tài)；若損傷的DNA不完全修復(fù)或者無法修復(fù)時(shí)，DNA發(fā)生突變，染色體畸形，可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)功能改變[29]。DNA的修復(fù)模型在蜂群中體現(xiàn)在爬行蜂和形態(tài)與正常工蜂相近的畸形蜂。然而狄斯瓦螨確實(shí)扮演著病毒的生物傳遞媒介和造成某些病毒或依賴螨的病毒毒力增強(qiáng)的關(guān)鍵機(jī)理[14]，不同畸形等級(jí)蜂的出現(xiàn)或許是蜜蜂對(duì)蜂螨侵襲后的一種抗逆適應(yīng)性體現(xiàn)。