紅螯螯蝦累代繁養(yǎng)群體的遺傳多樣性分析

彭 剛，徐 宇，張 燕，王 靜，黃鴻兵，嚴(yán)維輝，許志強(qiáng)

( 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017 )

紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)，屬節(jié)肢動(dòng)物門，甲殼綱，十足目，擬螯蝦科，光殼蝦屬[1]，體色為褐綠色或綠色，雄性成蝦第一步足大螯的外側(cè)頂端有一鮮紅、柔軟的膜質(zhì)帶[2]，紅螯螯蝦原產(chǎn)澳大利亞北部，個(gè)體大，食性雜，耐低氧，養(yǎng)殖當(dāng)年即可上市，我國(guó)于1992年由湖北水產(chǎn)研究所引進(jìn)該品種進(jìn)行小規(guī)模試養(yǎng)。隨著人們對(duì)其基礎(chǔ)生物學(xué)特性不斷研究，養(yǎng)殖技術(shù)不斷完善，紅螯螯蝦在國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖范圍逐步擴(kuò)大，在海南、廣東、浙江、江蘇、湖北等地均有養(yǎng)殖成功的案例[3-4]，紅螯螯蝦國(guó)內(nèi)引進(jìn)近30年，許多地區(qū)已建立了自己的繁育基地，實(shí)現(xiàn)了保種越冬、自繁自養(yǎng)。

線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因位于線粒體DNA中，是線粒體基因組13種氨基酸編碼序列之一，中度保守，進(jìn)化速率適中，既能保證足夠的變異又易于擴(kuò)增，且很少存在插入與缺失，適合種群水平差異的檢測(cè)[5-6]。近十年來(lái)，COⅠ基因被廣泛應(yīng)用于物種分類及種內(nèi)種間遺傳分化研究[7-11]。目前國(guó)內(nèi)大部分紅螯螯蝦的繁養(yǎng)基地主要依賴于自有群體的養(yǎng)殖繁殖，經(jīng)過(guò)多代的自繁自育后其遺傳多樣性如何，國(guó)內(nèi)較少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，僅謝雁南[12]對(duì)3個(gè)地區(qū)的紅螯螯蝦開(kāi)展了群體遺傳學(xué)分析。為有效評(píng)估國(guó)內(nèi)不同地區(qū)繁養(yǎng)基地紅螯螯蝦種質(zhì)資源狀況，分析遺傳多樣性及遺傳分化水平，項(xiàng)目組采集了6個(gè)主要繁養(yǎng)區(qū)域的紅螯螯蝦，基于線粒體DNA COⅠ基因序列對(duì)不同群體的遺傳多樣性進(jìn)行初步評(píng)估，為后續(xù)開(kāi)展紅螯螯蝦的培育以及選育工作積累數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用紅螯螯蝦于2018年10—12月采自國(guó)內(nèi)6個(gè)紅螯螯蝦繁養(yǎng)區(qū)，分別為安徽阜陽(yáng)、浙江湖州、廣東珠海、江蘇鎮(zhèn)江、海南澄邁、江蘇蘇州，樣本采集量均為100尾以上，每個(gè)群體隨機(jī)取30尾用于后續(xù)的群體遺傳學(xué)分析。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制備

取紅螯螯蝦尾部肌肉組織，常規(guī)酚—氯仿法提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性，紫外分光光度法檢測(cè)樣品DNA含量及純度。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

參照紅螯螯蝦COⅠ基因序列(GenBank：HG942364.1)設(shè)計(jì)引物用于線粒體COⅠ基因擴(kuò)增和序列測(cè)定。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，COⅠ-F: 5′-TTGTGTTCGGAGCCTGAT-3′; COⅠ-R: 5′-AGAAGGTCTTCCTGGTAGG-3′。對(duì)每個(gè)樣本的線粒體 COⅠ基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL：模板DNA 25 ng，2×PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O補(bǔ)足體積。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，經(jīng)30個(gè)循環(huán)再72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)DL2000 Ladder(TAKARA)估算產(chǎn)物大小。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序獲取序列信息。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過(guò)雙向測(cè)序獲得紅螯螯蝦線粒體COⅠ序列，經(jīng)SeqManⅡ(DNASTAR Inc)軟件拼接并進(jìn)行人工核查和校正，所獲序列用Clustal X軟件進(jìn)行比對(duì)，用Mega 6.0軟件中的Kimura雙參數(shù)法計(jì)算遺傳距離。用Modeltest 3.16計(jì)算位點(diǎn)間堿基替代率的Gamma分布參數(shù)，并以鄰接法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)。通過(guò)單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析當(dāng)前不同繁養(yǎng)區(qū)紅螯螯蝦群體的遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異特征分析

共獲取了6個(gè)紅螯螯蝦群體共180個(gè)樣品的線粒體COⅠ基因序列，對(duì)其進(jìn)行對(duì)比分析，比對(duì)長(zhǎng)度為831 bp，其中變異位點(diǎn)為56個(gè)，變異比率為6.7%，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)16個(gè)，單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)76個(gè)。平均A、T、G、C堿基含量分別為27.840%、32.395%、14.848%、24.917%。紅螯螯蝦線粒體COⅠ基因G+C(%)含量較低39.765%，表現(xiàn)出較為明顯的堿基組成偏倚性。

在6個(gè)群體180個(gè)樣本中共檢測(cè)出 10 種單倍型(表1)。安徽阜陽(yáng)群體與江蘇蘇州群體、海南澄邁3個(gè)群體間有2個(gè)共享單倍型 (H1/H3)。單倍型H1出現(xiàn)次數(shù)最多，為浙江湖州以外的5個(gè)群體的共享單倍型，單倍型 H2、H5、H7以及H10分別為安徽阜陽(yáng)、海南澄邁、浙江湖州以及江蘇蘇州群體所特有的單倍型。

表1 紅螯螯蝦6個(gè)群體COⅠ基因單倍型(H1～H10)的分布

遺傳多樣性結(jié)果表明，本試驗(yàn)中所涉及的紅螯螯蝦群體均具有較高的遺傳多樣性(表 2)，其總體單倍型多樣性指數(shù)為0.693，核苷酸多樣性指數(shù)為0.00652。其中，江蘇蘇州群體的單倍型多樣性指數(shù)最高(0.964)，海南澄邁群體最低(0.618)，核苷酸多樣性指數(shù)以浙江湖州群體最高(0.01587)，海南澄邁群體最低(0.01219)。

表2 紅螯螯蝦6個(gè)群體遺傳多樣性指數(shù)

2.2 群體結(jié)構(gòu)及分子遺傳變異

6個(gè)紅螯螯蝦群體間的遺傳距離為0.00403～0.00969(表3)。其中海南澄邁群體和安徽阜陽(yáng)群體間的遺傳距離較大，為0.00969，廣東珠海群體和江蘇蘇州群體間的遺傳距離最小，為0.00403。其中安徽阜陽(yáng)群體與其他5個(gè)群體間的遺傳距離均較遠(yuǎn)。

表3 紅螯螯蝦6個(gè)群體間的遺傳距離

以鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系圖顯示，江蘇蘇州群體和浙江湖州群體首先聚為一支，并逐漸與江蘇鎮(zhèn)江、海南澄邁、廣東珠海群體聚集，安徽阜陽(yáng)群體單獨(dú)為一支(圖1)。

圖1 紅螯螯蝦6個(gè)群體的聚類分析

3 討 論

3.1 紅螯螯蝦COⅠ基因片段變異及特征分析

紅螯螯蝦原產(chǎn)于澳大利亞北部及昆士蘭西北部地區(qū)，我國(guó)最早于1992年由湖北水產(chǎn)研究所引進(jìn)，1998年浙江湖州突破了紅螯螯蝦規(guī)?；斯し敝臣夹g(shù)，目前江蘇、浙江、廣東、海南等地是我國(guó)紅螯螯蝦的主要養(yǎng)殖地區(qū)。多年來(lái)，由于群體引進(jìn)記錄不完善，國(guó)內(nèi)不同繁養(yǎng)群體的遺傳特征(特別是不同群體間的親緣關(guān)系)尚未被系統(tǒng)研究，紅螯螯蝦養(yǎng)殖過(guò)程中又存在無(wú)序留種、單一群體累代繁殖等問(wèn)題，養(yǎng)殖過(guò)程中相繼出現(xiàn)病害頻發(fā)等現(xiàn)象。為解決種群退化問(wèn)題，國(guó)內(nèi)相關(guān)企業(yè)已多次從國(guó)外引進(jìn)紅螯螯蝦對(duì)國(guó)內(nèi)繁養(yǎng)群體進(jìn)行種質(zhì)更新。在紅螯螯蝦引種過(guò)程中，由于不同批次引進(jìn)群體的遺傳特征數(shù)據(jù)尚未獲取，無(wú)序引種一方面造成了巨大的資金浪費(fèi)，同時(shí)也限制了國(guó)內(nèi)已有繁養(yǎng)群體的應(yīng)用潛力。因此，對(duì)國(guó)內(nèi)不同繁養(yǎng)基地已有紅螯螯蝦群體進(jìn)行遺傳特征分析，獲取其遺傳多樣性及不同群體間的親緣關(guān)系數(shù)據(jù)，對(duì)于有效利用國(guó)內(nèi)已有紅螯螯蝦種質(zhì)資源具有重要的意義。

謝雁南[12]利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)廈門、廣州、崇明3個(gè)紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)群體的平均表觀雜合度為0.648～0.679，平均期望雜合度為0.535～0.567，平均多態(tài)信息含量為0.451～0.480，每個(gè)點(diǎn)位等位基因數(shù)為2～7，養(yǎng)殖群體尚未出現(xiàn)種質(zhì)退化。線粒體基因組具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子小、進(jìn)化快等特征，遵循嚴(yán)格的母系遺傳，幾乎不發(fā)生重組，不同區(qū)域的進(jìn)化速度存在差異，而被廣泛應(yīng)用于種群遺傳分化及多樣性的研究[13-14]，本試驗(yàn)遺傳多樣性分析結(jié)果表明，國(guó)內(nèi)紅螯螯蝦累代繁育群體均具有較高的遺傳多樣性，這與上述謝雁南[12]得出的養(yǎng)殖群體尚未出現(xiàn)種質(zhì)退化結(jié)論基本相同。究其原因，主要與該品種引入國(guó)內(nèi)時(shí)間較短，同時(shí)部分繁養(yǎng)基地由于前期繁養(yǎng)不成功，會(huì)從其他繁養(yǎng)基地或澳大利亞、中國(guó)臺(tái)灣補(bǔ)充少量種蝦，群體間的基因交流也有效保持了各群體均具有較高的遺傳多樣性。6個(gè)群體中海南澄邁群體和廣東珠海群體單倍型多樣性較低，推測(cè)或因紅螯螯蝦在該地區(qū)繁養(yǎng)環(huán)境條件較為適宜，養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)較為豐富，基本解決“繁養(yǎng)推”一體化，多年的自繁自養(yǎng)等因素導(dǎo)致其遺傳多樣性相對(duì)較低。浙江是國(guó)內(nèi)較早攻克紅螯螯蝦室內(nèi)人工苗種繁育技術(shù)的地區(qū)，該地區(qū)苗種的供給比較成熟，有相對(duì)獨(dú)立的親本引繁體系。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，浙江繁養(yǎng)群體缺乏H1單倍型，推測(cè)浙江群體與其他群體間的基因交流相對(duì)較少，而且該單倍型可能來(lái)源于最新從國(guó)外引進(jìn)的紅螯螯蝦群體。

3.2 不同繁育基地紅螯螯蝦遺傳距離及交流情況

Nei[15]認(rèn)為，群體間的遺傳距離為0.00～0.05。本研究中6個(gè)紅螯螯蝦群體間的遺傳距離為0.00403～0.00969，低于李吉濤等[16]測(cè)定的脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)渤海灣、萊州灣、膠州灣、海州灣4群體間的遺傳距離(0.0153～0.0345)。由6個(gè)群體間遺傳距離結(jié)果來(lái)看，由于交流頻繁，廣東珠海群體和江蘇蘇州群體間遺傳距離最小，同時(shí)由于地緣關(guān)系江浙一帶群體間遺傳距離也較小，但安徽阜陽(yáng)群體與其他5個(gè)群體間的遺傳距離均較遠(yuǎn)，推測(cè)與其親本引進(jìn)渠道及外界交流較少有關(guān)。紅螯螯蝦在江浙等內(nèi)陸地區(qū)不能自然繁殖，無(wú)法自然進(jìn)行種群的擴(kuò)散繁衍，其種質(zhì)的保存與更新完全依賴人為的干預(yù)。

3.3 紅螯螯蝦資源的保護(hù)與利用

養(yǎng)殖業(yè)會(huì)受到長(zhǎng)期近親繁殖帶來(lái)的產(chǎn)量下降等一系列影響[17]，本試驗(yàn)結(jié)果初步表明，目前我國(guó)紅螯螯蝦繁養(yǎng)群體遺傳多樣性水平仍然較高，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖行業(yè)的推進(jìn)，紅螯螯蝦長(zhǎng)期自繁自養(yǎng)的弊端可能會(huì)逐步凸顯，如何加強(qiáng)對(duì)種質(zhì)資源的評(píng)估和繁育群體多樣性的保護(hù)更新，對(duì)推動(dòng)紅螯螯蝦產(chǎn)業(yè)長(zhǎng)期健康穩(wěn)定發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。