基于16S rRNA基因分析雙斑東方鲀腸道微生物多樣性

雷 陽，王松剛，陳 鈺，姜 堯，鄭 毅,2

( 1.福建師范大學 生命科學學院，福建 福州 350117； 2.福建師范大學 南方海洋研究院，福建 福州 350117 )

河鲀魚肉味鮮美，廣受人們的喜愛，但因其體內(nèi)含有河鲀毒素，因此河鲀的食用受到限制。早在1990年，我國在《水產(chǎn)品衛(wèi)生管理辦法》中寫到：河鲀魚有劇毒，不得流入市場。河鲀毒素是一種劇毒，其毒性是氰化物的1000余倍，不慎食入會口舌、肌肉麻痹，四肢無力，惡心嘔吐，癱瘓，嚴重者會呼吸困難，窒息而亡，并且迄今為止尚無可以解除此毒的特效藥物[1]。關(guān)于河鲀毒素的起源一直存在爭議，主要有內(nèi)因說和外因說，內(nèi)因說主張河鲀毒素是由其自身產(chǎn)生，河鲀魚體內(nèi)存在某種機制可以將攝入的食物轉(zhuǎn)化為毒素，1998年kendo[2]證實，胚胎可以產(chǎn)生河鲀毒素，但目前該假說由于證據(jù)不足，尚未得到研究者的普遍認可。外因說主要指食物鏈假說和微生物起源假說。王少蓉等[3]在黃鰭東方鲀(Takifuguxanthopterus)的卵巢中篩選出產(chǎn)毒能力較強的EL10菌株。邢磊[4]自橫紋東方鲀(T.oblongus)腸道分離到菌株HDC13、HDC35、HDC37，將3株菌混合培養(yǎng)后其產(chǎn)物對老鼠有較強的致死效果，這為外因說提供有力的證據(jù)。人工養(yǎng)殖的河鲀通常低毒或無毒，這一差異與野生和養(yǎng)殖河鲀腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)有很大聯(lián)系。筆者擬通過16S rRNA基因V3～V4區(qū)的Miseq PE300測序，對野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀(T.bimaculatus)腸道微生物進行多樣性分析，以期揭示野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀腸道微生物中優(yōu)勢菌群的組成，為探明菌群多樣性的進化規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年11月進行樣品采集，3尾野生雙斑東方鲀采于廈門同安海域，3尾養(yǎng)殖雙斑東方鲀采于漳州養(yǎng)殖場，6個樣品規(guī)格相似。根據(jù)國家標準GB 5009.206—2016檢測，野生雙斑東方鲀腸道內(nèi)河鲀毒素的含量小于1.5 MU/g，養(yǎng)殖雙斑東方鲀腸道內(nèi)河鲀毒素含量小于0.04 MU/g。

1.2 樣品處理

用75%酒精擦拭河鲀的表面3次，然后在無菌的條件下，用滅過菌的解剖器取其腸道內(nèi)容物于滅菌的PE管中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA的提取和擴增

用E.Z.N.A. Stool DNA Kit試劑盒提取DNA。將提取的DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用分光光度法(260 nm/280 nm光密度比)檢測含量和純度。檢測后將樣品保存于-20 ℃?zhèn)浜罄m(xù)試驗使用。

以提取DNA為模板，細菌16S rDNA V3～V4擴增引物為338 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3′)和806 R(5′-GGACTACNNGGGTATCT AAT-3′)進行PCR。PCR反應體系：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，3 μL BSA(2 ng/μL)，2 μL引物(5 μmol/L)，2 μL模板DNA和5.5 μL ddH2O。反應參數(shù)：95 ℃預變性5 min， 95 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，32個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測后按等量混合，進行Illumina測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

PCR擴增產(chǎn)物采用Illumina MiSeq平臺進行雙端測序，測序原始序列上傳至美國國立生物技術(shù)信息中心的SRA數(shù)據(jù)庫，下機數(shù)據(jù)去除接頭序列和引物并拼接，進一步去除嵌合體、短序列后得到優(yōu)質(zhì)序列。根據(jù)接頭序列對各個樣本進行相似度為97%的運算分類單元(OTU)聚類，將得到的運算分類單元與Silva數(shù)據(jù)庫(128)進行對比，得到每個運算分類單元對應的物種分類信息。

樣本的Alpha多樣性通過Chao-1、observed-species、PD_whole_ tree、香農(nóng)指數(shù)表示，其中observed-species、Chao-1、PD_whole_ tree用來評估樣本物種豐度，而香農(nóng)指數(shù)用來評估樣本多樣性。

Chao1：即菌種豐富度指數(shù)，用以估計群落中的運算分類單元數(shù)目。

Schao1=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1)

式中，Schao1為估計的運算分類單元數(shù)，Sobs為觀測到的運算分類單元數(shù)，n1為只有一條序列的運算分類單元數(shù)目，n2為只有兩條序列的運算分類單元數(shù)目。

observed_species：隨測序深度的增加，實際觀測到運算分類單元的個數(shù)。

goods_coverage：觀測深度。

C=1-n1/N

式中，n1為只有含一條序列的運算分類單元數(shù)目，N為抽樣中出現(xiàn)的總的序列數(shù)目。

香農(nóng)指數(shù)：用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一。

H=-∑PilnPi

式中，H為香農(nóng)指數(shù)，Pi為樣品中屬于第i種的個體的比例。

利用QIIME軟件(版本號1.8)估計樣本多樣性并制作韋恩圖。

使用R語言vegan包、vegdist和hclust進行距離計算和聚類分析，構(gòu)建基于未加權(quán)距離矩陣，UPGMA方法聚類建樹，并將聚類結(jié)果與各樣品在門、綱、目、科、屬水平上的物種相對豐度整合展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果和基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計

通過Illumina Miseq PE300高通量測序，在去除接頭序列和引物并拼接后，經(jīng)進一步去除嵌合體、短序列后，6份樣品共得到優(yōu)質(zhì)序列99 500條，平均序列條數(shù)為16 583條，其中優(yōu)質(zhì)序列最多為27 781條，優(yōu)質(zhì)序列最少為7182條，對優(yōu)質(zhì)序列長度統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)序列多集中在400～420 bp和420～440 bp，然后將優(yōu)質(zhì)序列進行97%相似度的運算分類單元聚類分析。

由圖1～2可見，當測序量在2000以下時，運算分類單元的數(shù)目在迅速增加，香農(nóng)指數(shù)趨于平緩，當測序量在6000多時，所有樣品的稀釋曲線仍在上升而香農(nóng)指數(shù)已經(jīng)達到飽和，盡管增加更多的數(shù)據(jù)量會產(chǎn)生新的運算分類單元，但目前的測序量已經(jīng)能夠反映樣品中細菌的多樣性。

圖1 樣品稀釋曲線

2.2 群落結(jié)構(gòu)分析

對樣品中的微生物群落進行分析，由于序列長度以及數(shù)據(jù)庫的原因，運算分類單元注釋只獲得了門、綱、目、科、屬幾個水平，微生物種類和相對豐富度無法具體到種水平的分類。

圖2 細菌香農(nóng)指數(shù)

2.2.1 細菌在門水平上進行分類及比較

測得序列經(jīng)過鑒定，在門水平主要為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、螺旋菌門、硝化螺旋菌門、梭桿菌門、芽單胞菌門、放線菌門、綠彎菌門，從門水平的分析可以看出：變形菌門在野生雙斑東方鲀和養(yǎng)殖雙斑東方鲀中都占有很大的比例，為優(yōu)勢菌，梭桿菌門在野生雙斑東方鲀中占的比例相對較大，分別為13.13%、7.65%和0.09%，而梭桿菌門在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中占的比例相對較少，分別為0.02%、0.02%和0.03%。螺旋菌門和擬桿菌門在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中明顯比在野生雙斑東方鲀中所占比例高(圖3)。

圖3 細菌門水平的菌群分布

2.2.2 細菌在屬水平上進行分類及比較

從屬的水平進行分析得知，養(yǎng)殖雙斑東方鲀中相對豐度大于1%的共有8個屬，分別為弓形桿菌屬(Arcobacter,39.63%)、短螺旋體屬(Brevinema，10.44%)、理研菌屬(Rikenella，8.25%)、弧菌屬(Vibrio,1.14%)、硝化螺菌屬(Nitrospira,5.26%)、乳桿菌屬(Lactobacillus,1.31%)、反硝化細菌(Denitratisoma，1.1%)、擬桿菌屬(Bacteroides,1.07%)，未鑒定的細菌屬占總細菌屬的16.5%。野生雙斑東方鲀中相對豐度超過1%的有弓形桿菌屬(35.97%)、內(nèi)皮單胞菌屬(Endozoicomonas，17.56%)、弧菌屬(7.21%)、硝化螺菌屬(2.6%)、希瓦氏菌屬(Shewanella,4.2%)、纖毛菌屬(Propionigenium,3.52%)、鯨桿菌屬(Cetobacterium,3.44%)、Romboutsia(1.01%),未鑒定的細菌屬占總細菌屬的12.31%。希瓦氏菌屬、纖毛菌、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)是野生雙斑東方鲀特有的(圖4)。

圖4 細菌屬水平的菌群分布

2.3 雙斑東方鲀腸道細菌Alpha多樣性分析

從Chao1、observed-species、PD_whole_ tree、香農(nóng)指數(shù)4個方面使用Alpha多樣性指數(shù)進行統(tǒng)計分析，由圖5可見，Chao1、observed-species、PD_whole_ tree、香農(nóng)指數(shù)均為養(yǎng)殖型雙斑東方鲀大于野生型雙斑東方鲀，表明養(yǎng)殖型雙斑東方鲀腸道細菌多樣性和豐富度高于野生型雙斑東方鲀。

圖5 Alpha多樣性指數(shù)box圖

韋恩圖(圖6)可以直觀地反映樣品共有和各自特有的運算分類單元數(shù)目，對樣品進行相似度97%的聚類，野生雙斑東方鲀運算分類單元數(shù)目為524，獨有的運算分類單元數(shù)目為68, 其中OTU-18占3.415%，OTU-61占0.955%，OTU-33占0.945%，OTU-48占0.570%、OTU-81占0.37%，養(yǎng)殖雙斑東方鲀運算分類單元數(shù)目為576，獨有的運算分類單元數(shù)目為120，OTU-274占0.075%、OTU-565占0.040%。養(yǎng)殖雙斑東方鲀的運算分類單元數(shù)目比野生雙斑東方鲀的運算分類單元數(shù)目多，說明養(yǎng)殖雙斑東方鲀腸道細菌的種類比野生雙斑東方鲀腸道細菌的種類更豐富。

圖6 樣品中細菌群落共享和獨有運算分類單元的韋恩圖

2.4 Beta多樣性分析

主成分分析，一種可以對測得的數(shù)據(jù)進行簡單化分析的技術(shù)。通過分析不同樣本運算分類單元(97%相似性)組成可以反映樣本間的差異和距離，將數(shù)據(jù)進行R語言主成分作圖和分析(圖7)。基于UniFrac的非加權(quán)分析，第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為60.19%和20.80%。養(yǎng)殖雙斑東方鲀生活范圍相對有限，生活環(huán)境相似，因此3個樣品比較集中，野生雙斑東方鲀由于生活范圍廣泛，生活環(huán)境多變，3個樣品相對比較分散。

圖7 基于運算分類單元水平的主成分分析

聚類分析的熱圖見圖8。圖中橫坐標代表樣本的名稱，縱坐標代表聚類情況，圖中不同顏色的方塊代表每個樣品屬的豐度，顏色的深淺變化的差異性和相似性代表不同樣品群落組成的相似程度。弓形桿菌屬在兩種雙斑東方鲀中占的比值最大，在養(yǎng)殖雙斑東方鲀占比39.6%，在野生雙斑東方鲀占比35.97%，希瓦氏菌屬、纖毛菌、發(fā)光桿菌屬在野生雙斑東方鲀腸道有發(fā)現(xiàn)，而在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中沒有發(fā)現(xiàn)，Brevinema在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中占10.4%，在野生雙斑東方鲀中只占0.26%，表明不同生活環(huán)境的魚腸道微生物群落的組成不同且差異性較大。

圖8 聚類分析的熱圖(屬水平)

3 討 論

3.1 野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀魚腸道微生物多樣性分析

腸道是動物體物質(zhì)代謝與吸收的主要場所，而腸道的重要組成部分是腸道微生物，腸道微生物在動物的發(fā)育、進化、機體代謝方面有重要的作用[5-6]。對于在脊椎動物中占比最大的魚類腸道中的微生物也備受人們的關(guān)注。本試驗采集野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀樣品規(guī)格相似，由于生境不同，兩者腸道細菌菌群的多樣性有明顯的差異，野生雙斑東方鲀和養(yǎng)殖雙斑東方鲀的總運算分類單元數(shù)目并無明顯差異，但野生雙斑東方鲀獨有的運算分類單元數(shù)目為68，其中OTU-18占比最大，為3.415%，養(yǎng)殖雙斑東方鲀獨有的運算分類單元數(shù)目為120，占比最大的為OTU-274，僅占0.075%。Alpha多樣性分析結(jié)果顯示，養(yǎng)殖雙斑東方鲀腸道細菌多樣性和豐富度高于野生雙斑東方鲀，這是因為宿主的飲食、生活環(huán)境、年齡等因素都會影響腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)與組成[7]。在門水平上的分析結(jié)果顯示，變形菌門為野生雙斑東方鲀和養(yǎng)殖雙斑東方鲀腸道菌群的優(yōu)勢菌。梭桿菌門在野生雙斑東方鲀腸道中占有很大比例，在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中所占比例相對較少。文獻報道，變形菌門和梭桿菌門是大多數(shù)魚類腸道微生物的主要菌群，蘇月華等[8]對33只白甲魚(Onychostomasima)腸道內(nèi)容物進行高通量測序結(jié)果顯示，白甲魚腸道菌群主要是梭桿菌門、變形菌、螺旋菌門、厚壁菌門，其中梭桿菌門和變形菌門占比高達82%。Wu等[9]用高通量測序方法對草魚腸道菌群進行研究，發(fā)現(xiàn)其主要為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門。屬水平上的分析結(jié)果顯示，弓形桿菌屬、弧菌屬、硝化螺菌屬在兩者中均占有較大比例。弧菌屬為養(yǎng)殖和野生雙斑東方鲀腸道菌群的優(yōu)勢菌之一，這一結(jié)果符合弧菌為海水魚腸道的主要菌群的說法[10]。據(jù)報道，紅鰭東方鲀(T.rubripes)[11]腸道常見的細菌為弧菌屬、希瓦氏菌屬、假交替單胞菌屬和芽孢桿菌屬(Bacillus)?；【鷮?、希瓦氏菌屬、芽孢桿菌屬在星點東方鲀(T.niphobles)[12]腸道內(nèi)容物中也有發(fā)現(xiàn)。邢磊[4]自橫紋東方鲀腸道內(nèi)容物篩到49株菌，其中弧菌屬有28株，發(fā)光桿菌屬有1株，假交替單胞菌屬3株，希瓦氏菌屬有4株，這些細菌在雙斑東方鲀腸道中均有發(fā)現(xiàn)。

3.2 野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀魚腸道微生物多樣性與河鲀毒素的相關(guān)性

由于紅鰭東方鲀得病率高，死亡率高，而水域?qū)Π导y東方鲀具有限制性，福建地區(qū)近幾年主要以養(yǎng)殖菊黃東方鲀(T.flavidus)和雙斑東方鲀?yōu)橹?，雙斑東方鲀的抗病能力較菊黃東方鲀強，因此雙斑東方鲀投苗量越來越多[13]。野生雙斑東方鲀和養(yǎng)殖雙斑東方鲀最大區(qū)別在于河鲀毒素含量的差異性，前者比后者含量高37.5倍。關(guān)于河鲀毒性產(chǎn)生有微生物起源的學說，近幾年，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種能產(chǎn)生河鲀毒素的細菌，主要有弧菌、假單胞菌、芽孢桿菌、交替單胞菌(Alteromonas)、發(fā)光桿菌、放線菌等。岳田芳[14]在海藻希瓦氏菌(S.algae)發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到了河鲀毒素。王少蓉等[3]在黃鰭東方鲀中篩選出產(chǎn)河鲀毒素能力較強的EL10菌株，經(jīng)鑒定也屬于希瓦氏菌屬。王冠男等[15]指出，海膽中存在的假交替單胞菌可以產(chǎn)河鲀毒素，而從紅鰭東方鲀體內(nèi)分離出的達松維爾擬諾卡氏放線菌(Nocardiopsisdassonvillei)和梭形芽孢桿菌(B.fusiformis)可以產(chǎn)河鲀毒素。希瓦氏菌屬、纖毛菌屬、發(fā)光桿菌屬、假交替單胞菌屬存在于野生雙斑東方鲀腸道中，而在養(yǎng)殖雙斑東方鲀中未發(fā)現(xiàn)，因此腸道產(chǎn)毒菌群的差異性與野生和養(yǎng)殖雙斑東方鲀毒性的差異可能具有某種聯(lián)系，這為探究河鲀毒素微生物源提供一定的科學依據(jù)。