超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定魚(yú)、蝦中4種抗病毒藥物的殘留

張玉昆，劉振先，徐 歌，鄭曉瑩，劉錦信，繆小群

( 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000 )

抗病毒藥物作為人類(lèi)治療病毒性疾病的專(zhuān)用藥，移作獸用缺乏科學(xué)依據(jù)[1]。2005年，美國(guó)食品藥物管理局已經(jīng)下令禁止把人類(lèi)抗病毒藥物濫用于畜禽中[2]，與此同時(shí)我國(guó)農(nóng)業(yè)部第560號(hào)公告也曾明令禁止抗病毒藥物作為獸藥使用[3]。雖然抗病毒藥屬動(dòng)物禁用藥物，但其在動(dòng)物養(yǎng)殖中依然使用廣泛。金剛烷胺、金剛乙胺有致畸性，會(huì)損害人體的生殖系統(tǒng), 可導(dǎo)致精神病患者精神分裂癥狀加重,并出現(xiàn)難治性雙下肢水腫[4]。若飼養(yǎng)者不科學(xué)、不合理地使用該藥物，易導(dǎo)致藥物在畜禽機(jī)體內(nèi)殘留與富集，不僅會(huì)造成畜禽中毒，也會(huì)引起病毒耐藥毒株的出現(xiàn)使抗病毒藥物有效性降低，其耐藥性也有轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到人體的風(fēng)險(xiǎn)[5]，對(duì)消費(fèi)者的健康存在很大的隱患。

國(guó)內(nèi)外主要采用酶聯(lián)免疫法[6]、氣相色譜法[7]、液相色譜法[8]、液相色譜—質(zhì)譜法[9-15]等檢測(cè)動(dòng)物組織中的金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛和嗎啉胍。目前，我國(guó)對(duì)于水產(chǎn)品中抗病毒藥物藥物殘留檢測(cè)的研究還比較少， 尚未制定相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。筆者在查閱大量文獻(xiàn)基礎(chǔ)上對(duì)儀器參數(shù)和樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，建立的分散固相萃取—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法，能夠同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中的金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛和嗎啉胍，方法簡(jiǎn)單，操作方便，為批量檢測(cè)樣品中金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛和嗎啉胍等違禁藥物的殘留量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品包括凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)、鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)、新對(duì)蝦(Metapenaeussp.)等，均為市售樣品。

試劑:甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)SccBayer公司)；甲酸、乙酸(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑廠)；三氯乙酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；C18(粒徑40 μm)；PSA(美國(guó)Agilen公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：金剛烷胺(純度98%，中國(guó)食品藥品鑒定研究所)；美金剛(純度99.2%，美國(guó)Sigma公司)；金剛乙胺(純度99%，美國(guó)Sigma公司)；嗎啉胍(純度98.3%，日本TCI公司)；金剛烷胺-d15(純度99.3%，加拿大Toronto Research Chemicals公司)。

1.2 儀設(shè)備器

API4000超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)；lHSC-24B氮吹濃縮儀(天津恒奧科技)；JW-3021HK低溫超高速離心機(jī)(安徽嘉文)；MTV-100渦旋混合器(德國(guó)IKA公司)；高速分散均質(zhì)機(jī)(上海本昂)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 抗病毒藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、嗎啉胍10 mg(按實(shí)際含量折算，精確至0.0001)，分別置100 mL容量瓶中使用甲醇溶解并稀釋?zhuān)涑?.1 mg/mL外標(biāo)儲(chǔ)備溶液，-18 ℃下保存。甲醇稀釋備用。

1.3.2 抗病毒藥物混合中間液的配制

取適量配制好的抗病毒藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，甲醇定容，配制成1.0 μg/mL的混標(biāo)儲(chǔ)備液，-18 ℃下保存。甲醇稀釋備用。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18-AQ HP(3 μm，2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相:A(0.1%甲酸水)，B(甲醇)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI+)；掃描方式：正離子掃描；氣簾氣壓力：25 psi(1 psi=6.8948 kPa)；離子源噴霧電壓：5500 V；碰撞氣壓力：5 psi; 離子源溫：550 ℃；噴霧氣壓力：60 psi；加熱輔助霧化氣壓力：55 psi；柱溫35 ℃；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量等見(jiàn)表2。

表2 目標(biāo)化合物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)

1.5 樣品前處理方法

稱(chēng)取2 g處理好的樣(精確至0.01 g)，于50 mL聚丙烯具塞離心管中，加入40 μL金剛烷胺-d15內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入1%三氯乙酸和1%乙酸乙腈(1∶9，體積比)10 mL提取，渦旋振蕩5 min，超聲15 min后用冷凍高速離心機(jī)9000 r/min，4 ℃離心5 min取上清液于另一支50 mL離心管中。在殘?jiān)屑尤? mL提取劑重復(fù)上述操作，合并上清液，于45 ℃水浴氮吹至近干。用初始流動(dòng)相復(fù)溶并定容1 mL，將復(fù)溶后的液體全部轉(zhuǎn)移到裝有30 mg PSA、30 mg C18、50 mg中性氧化鋁的2 mL的離心管中，渦旋振蕩5 min，9000 r/min，4 ℃，離心5 min。將上述離心后的凈化液過(guò)0.22 μm濾膜待上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法線性范圍及檢出限結(jié)果

4種抗病毒類(lèi)藥物的質(zhì)量濃度為1～100 μg/L，采用內(nèi)標(biāo)法，以待測(cè)物的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，以待測(cè)物定量離子的峰面積與內(nèi)標(biāo)定量離子的峰面積之比作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；此外，在空白鯉魚(yú)肉、草魚(yú)肉、凡納濱對(duì)蝦樣品中加入4種抗病毒類(lèi)藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過(guò)提取和凈化后，進(jìn)行儀器檢測(cè)，以3倍信噪比為檢出限，以10倍信噪比為定量限。4種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限見(jiàn)表3。

表3 線性方程與檢出限

2.2 方法的回收率和精密度結(jié)果

以空白鯉魚(yú)、草魚(yú)、凡納濱對(duì)蝦作為樣品基質(zhì)，在 1、10、50 μg/kg含量水平上(表4)添加4種抗病毒藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法測(cè)定并計(jì)算回收率，每個(gè)添加水平測(cè)定6個(gè)平行樣品，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在空白鯉魚(yú)、草魚(yú)、凡納濱對(duì)蝦樣品中4種抗病毒藥物的回收率為86.0%～98.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8%，本試驗(yàn)所建立方法的精密度與回收率均能達(dá)到殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。各特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1～2。

圖1 10 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖

表4 空白鯉魚(yú)、草魚(yú)、凡納濱對(duì)蝦中4種抗病毒藥添加回收率和精密度(n=6)

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

將建立的方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室留樣的20個(gè)魚(yú)、蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)，有一份新對(duì)蝦樣品中檢測(cè)出金剛烷胺含量為4.7 μg/kg。

3 討 論

3.1 儀器條件選擇

4種抗病毒藥物均含有胺基基團(tuán)易結(jié)合H+，帶正電荷，因此，在進(jìn)行質(zhì)譜掃描過(guò)程中采用正離子掃描模式。通過(guò)優(yōu)化離子源參數(shù)，確認(rèn)母離子峰，并進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，確保每個(gè)母離子均有3個(gè)子離子，同時(shí)監(jiān)測(cè)多個(gè)子離子能夠減少基質(zhì)造成的干擾，避免假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。在液相色譜流動(dòng)相中加入少量的甲酸會(huì)增強(qiáng)待測(cè)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度，這主要是由于酸提供了更多的H+。因此筆者選用0.1%甲酸溶液與甲醇為流動(dòng)相，對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，從而保證各個(gè)化合物有良好的峰形、分離度及響應(yīng)強(qiáng)度。

3.2 提取溶劑的選擇

金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、嗎啉胍均屬極性化合物，根據(jù)相似相溶原理此4種抗病毒藥物質(zhì)更易溶于極性有機(jī)試劑中，因此本試驗(yàn)考察了乙腈與甲醇的提取效果，相比甲醇而言，乙腈沉淀蛋白脂肪的效果更強(qiáng)，離心后的溶液更為干凈，這為后續(xù)凈化步驟提供了便利；此外，化合物中所含的胺基基團(tuán)，在酸性條件下帶正電荷易溶于水，因此本試驗(yàn)分別考察了三氯乙酸、甲酸、鹽酸及其與不同比例的乙腈的提取效果。通過(guò)比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)1%三氯乙酸和1%乙酸乙腈作為提取溶劑時(shí)基質(zhì)干擾較小且回收率高。

3.3 基質(zhì)凈化方式

魚(yú)、蝦中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物等干擾物[16]，如果不將其凈化而直接用于測(cè)定，就會(huì)產(chǎn)生較大的基質(zhì)抑制效應(yīng)[17]，影響檢測(cè)的靈敏度?？紤]到C18可有效去除脂類(lèi)、糖類(lèi)等親脂性雜質(zhì)，PSA粉可去除基質(zhì)中的脂肪酸和甾醇類(lèi)干擾物，中性氧化鋁通過(guò)路易斯酸堿作用、極性相互作用和離子交換作用能有效的吸附基質(zhì)中脂肪類(lèi)雜質(zhì)。本試驗(yàn)對(duì)C18粉、PSA粉及中性氧化鋁的凈化效果進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，這3種凈化劑單獨(dú)使用時(shí)或兩種一起使用時(shí)凈化效果均不理想。本試驗(yàn)考察了20～100 mg C18粉、20～100 mg PSA粉、30～100 mg中性氧化鋁不同組合對(duì)樣品的凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)30 mg C18粉、30 mg PSA粉與50 mg中性氧化鋁混合使用時(shí)能有效的降低基質(zhì)效應(yīng)，回收率均為86.0%～98.5%。

圖2 空白鯉魚(yú)肉中添加10 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白基質(zhì)MRM色譜圖

目前，我國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4253—2015中對(duì)抗病毒類(lèi)藥物的檢測(cè)低限為1.0 μg/kg[18]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)儀器參數(shù)和樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，建立了超高液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定魚(yú)、蝦中金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、嗎啉胍的分析方法，該方法獲得了較為滿意的分離效果，其準(zhǔn)確度、精密度和檢出限均滿足國(guó)內(nèi)相關(guān)法規(guī)的要求。本研究采用30 mg C18、30 mg PSA、50 mg中性氧化鋁凈化的方式結(jié)合Shim-pack GIST C18-AQ柱分離，有效解決了金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、嗎啉胍同時(shí)檢測(cè)干擾多、回收率低的難題，節(jié)約了試驗(yàn)成本，提高了工作效率；同時(shí)，通過(guò)同位素內(nèi)標(biāo)法定量，進(jìn)一步減小基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的誤差，使試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，特別適用于實(shí)際樣品的批量檢測(cè)。