4種水產(chǎn)藥物對寬體金線蛭幼苗的急性毒性研究

郭 坤，羅鳴鐘，阮國良，魏 巍，李 銳

( 1.長江大學(xué)，濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點實驗室(籌)，浙江 杭州 310021 )

寬體金線蛭(Whitmaniapigra)，俗稱水蛭、螞蝗、肉鉆子等，《中華人民共和國藥典》收錄的藥用水蛭的主要基原動物，屬環(huán)節(jié)動物門、蛭綱、無吻蛭目、黃蛭科、金線蛭屬[1]，是我國重要的水生經(jīng)濟動物。以寬體金線蛭為主要原料的醫(yī)藥制品，具有預(yù)防和治療心腦血管疾病的特殊功效，其藥用價值得到極大的提高[2-3]。醫(yī)藥市場對寬體金線蛭的需求主要來源于野生環(huán)境，然而由于過度捕撈和水域生態(tài)環(huán)境惡化等原因，野生寬體金線蛭資源出現(xiàn)匱乏，我國已有部分地區(qū)開始進行人工養(yǎng)殖[4]。

目前，對寬體金線蛭養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)的研究主要集中在人工繁殖[5-9]、苗種培育[10-11]、養(yǎng)殖[12-13]等方面，已取得一系列成果，促進了寬體金線蛭規(guī)?；B(yǎng)殖。然而，由于高密度的養(yǎng)殖，養(yǎng)殖水體環(huán)境不良，經(jīng)常暴發(fā)疾病，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來了較大的損失。關(guān)于安全用藥方面的研究較少，水產(chǎn)動物對藥物的敏感性差異較大，在疾病的預(yù)防和治療中若劑量不當(dāng)則可能會給養(yǎng)殖對象造成傷害甚至死亡。筆者通過研究硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀、辛硫磷4種常用水產(chǎn)藥物對寬體金線蛭的急性毒性作用，旨在為寬體金線蛭合理用藥和健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

寬體金線蛭幼苗由長江大學(xué)水生經(jīng)濟動物研究中心提供，采回后放于實驗室120 L水族箱中暫養(yǎng)7 d，用水為充分曝氣的自來水，水溫(25.0±1.5) ℃，pH 7.2～7.8，溶解氧(6.0±0.5) mg/L。供試寬體金線蛭幼苗身體健壯，活動正常，平均體質(zhì)量(0.062±0.006) g。

硫酸銅(天津市北辰方正試劑廠，有效成分99%)、聚維酮碘(武漢天辰生物科技有限公司生產(chǎn)，有效成分10%)、高錳酸鉀(鄭州中天實驗儀器有限公司，有效成分99%)、辛硫磷(武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司，有效成分40%)，4種水產(chǎn)藥物按有效質(zhì)量濃度配置試驗液。

1.2 試驗方法

寬體金線蛭具有前后兩個吸盤，爬行能力較強。為防止其在毒性脅迫過程中爬離藥液而造成結(jié)果的偏差，本研究中采用10 cm×10 cm×5 cm的80目封閉性網(wǎng)袋作為容器，網(wǎng)袋頂部設(shè)置一拉鏈結(jié)構(gòu)的開口，用于放入和取出寬體金線蛭。網(wǎng)袋放置在40 cm×50 cm×30 cm的塑料水箱中，網(wǎng)袋頂部四角系一尼龍繩，尼龍繩另一端固定在水箱上，以固定網(wǎng)袋。水箱中液體高度為10 cm，完全淹沒網(wǎng)袋，以保證寬體金線蛭在試驗過程中一直在藥液中，同一處理的3個網(wǎng)袋放于同一水箱中，水溫為(25.0±1.5) ℃，其他水質(zhì)指標與暫養(yǎng)期間相同。

急性毒性試驗參照文獻[14]的方法，選擇5個間距較大的藥物質(zhì)量濃度進行預(yù)試驗，觀察寬體金線蛭在96 h內(nèi)的活動情況，得出24 h全部死亡的最低質(zhì)量濃度和96 h未出現(xiàn)死亡的最高質(zhì)量濃度，根據(jù)此結(jié)果按照等對數(shù)間距設(shè)置正式試驗的質(zhì)量濃度。每種藥物設(shè)置5個質(zhì)量濃度梯度組(表1)和1個空白對照組，每個網(wǎng)袋放入10尾寬體金線蛭，每組設(shè)置3個平行。為保證容器中藥液劑量的穩(wěn)定，高錳酸鉀和聚維酮碘處理組每隔12 h更換一次藥液，其余組別每隔24 h更換一次。試驗開始的前6 h連續(xù)觀察寬體金線蛭的活動情況并記錄，及時清理死亡個體，以后在24、48、72、96 h時記錄成活數(shù)。死亡的判斷標準為：用玻璃棒輕觸靜止不動的寬體金線蛭，5 min無任何反應(yīng)，則判斷為死亡。

表1 4種水產(chǎn)藥物的試驗質(zhì)量濃度 mg/L

1.3 統(tǒng)計分析

采用寇式法(Karber)計算半致死質(zhì)量濃度(LC50)、安全質(zhì)量濃度(SC)和半致死質(zhì)量濃度的95%置信區(qū)間(CI)，并做試驗質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標與死亡率為縱坐標的直線回歸方程[15]，利用藥物毒性蓄積程度系數(shù)(MAC)來分析寬體金線蛭體內(nèi)對藥物的蓄積和降減變化[16]，相關(guān)計算公式如下：

LogLC50=Xm-d(∑p-0.5)

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

95%CI=LogLC50±1.96×d[∑(pg/n)]0.5

MAC=(t2LC50-t1LC50)/(t0LC50-tmLC50)×100%

式中，LC50為半致死質(zhì)量濃度(mg/L)，SC為安全質(zhì)量濃度(mg/L)，95%CI為半致死質(zhì)量濃度95%置信區(qū)間(mg/L)，MAC為藥物毒性蓄積程度系數(shù)(%)，Xm為最大質(zhì)量濃度的對數(shù)，d為相鄰質(zhì)量濃度的對數(shù)差值，p為死亡率(%)，∑p為各組死亡率之和，g為存活率(%)，n為每組試驗個數(shù)；t1LC50和t2LC50為觀察時段t1和t2的半致死質(zhì)量濃度值(mg/L)，t0LC50和tmLC50分別為試驗初始、結(jié)束時半致死質(zhì)量濃度(mg/L)。

2 結(jié) 果

2.1 中毒癥狀

各處理組，寬體金線蛭幼苗的中毒癥狀基本類似。試驗初期，各處理組的寬體金線蛭幼苗均表現(xiàn)出興奮的狀態(tài)，不停游動，高質(zhì)量濃度組(處理Ⅳ和Ⅴ)表現(xiàn)更加的興奮，瘋狂游動。3 h后，4種藥液高質(zhì)量濃度組的(處理Ⅳ和Ⅴ)寬體金線蛭幼苗變得安靜，停留在網(wǎng)袋底部，寬體金線蛭身體開始卷曲并出現(xiàn)少量蛻皮，5 h后，低質(zhì)量濃度組的寬體金線蛭也表現(xiàn)出類似的癥狀。6 h后，4種藥液高質(zhì)量濃度組的部分幼苗身體出現(xiàn)腫塊和黏液分泌量增多，此外，硫酸銅和辛硫磷高質(zhì)量濃度處理組的部分寬體金線蛭還出現(xiàn)吸盤充血和雄性生殖器外露的現(xiàn)象。8 h后，4種藥液高質(zhì)量濃度組的寬體金線蛭體色由茶褐色變?yōu)榛野咨?。大部分寬體金線蛭在毒性處理后臨近死亡時，體表出現(xiàn)一層無色透明的黏液或身體末端掛著未脫離的皮。

2.2 4種常用水產(chǎn)藥物對寬體金線蛭幼苗的急性致死效應(yīng)

由表2可知，在96 h的急性毒性試驗過程中，對照組的寬體金線蛭幼苗均未出現(xiàn)死亡情況，各質(zhì)量濃度處理組寬體金線蛭的死亡率均隨藥物質(zhì)量濃度的增加和試驗時間的延長而上升。低質(zhì)量濃度的高錳酸鉀對寬體金線蛭幼苗的急性致死效應(yīng)較小，96 h的死亡率低于30%。4種藥物最高試驗質(zhì)量濃度對寬體金線蛭幼苗的急性致死效應(yīng)均較大，96 h各組死亡率均達100%。

表2 4種水產(chǎn)藥物對寬體金線蛭幼苗的致死率

2.3 4種水產(chǎn)藥物對寬體金線蛭幼苗的毒性效應(yīng)

根據(jù)相關(guān)計算公式[17]得出硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀及辛硫磷對寬體金線蛭幼苗的半致死質(zhì)量濃度、半致死質(zhì)量濃度的95%置信區(qū)間、藥物毒性蓄積程度系數(shù)和安全質(zhì)量濃度(表3)。半致死質(zhì)量濃度均隨試驗時間的延長而下降，硫酸銅、聚維酮碘、高錳酸鉀及辛硫磷對寬體金線蛭幼苗的24 h半致質(zhì)量濃度分別為0.579、78.173、3.956、0.978 mg/L，48 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.389、67.898、3.327、0.836 mg/L，72 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.280、62.747、2.703、0.611 mg/L，96 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.241、56.058、2.313、0.493 mg/L。其安全質(zhì)量濃度依次為：硫酸銅0.053 mg/L<辛硫磷0.183 mg/L<高錳酸鉀0.706 mg/L<聚維酮碘15.367 mg/L。4種常用水產(chǎn)藥物對寬體金線蛭幼苗的藥物毒性蓄積程度系數(shù)隨著試驗時間的延長表現(xiàn)出不同的變化趨勢。

表3 4種水產(chǎn)藥物對寬體金線蛭幼苗的急性毒性特征分析

根據(jù)藥物質(zhì)量濃度對數(shù)和死亡率—概率單位的關(guān)系計算出4種藥物24、48、96 h的回歸方程(表4)。

表4 4種水產(chǎn)藥物對寬體金線蛭幼苗急性毒性的回歸方程分析

3 討 論

3.1 4種藥物對寬體金線蛭幼苗的急性毒性比較

半致死質(zhì)量濃度是衡量藥物對動物急性毒性作用強弱的關(guān)鍵指標，半致死質(zhì)量濃度與藥物毒性負相關(guān)[17]。通過試驗得知4種常用水產(chǎn)藥物對寬體金線蛭幼苗24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度值，但實際生產(chǎn)中多采用96 h半致死質(zhì)量濃度來確定藥物對水生動物的急性毒性大小。根據(jù)國家環(huán)?？偩职l(fā)布的毒性分類標準[18]，急性毒性96 h半致死質(zhì)量濃度<0.1 mg/L為劇毒，0.1～1.0 mg/L為高毒，1.0～10.0 mg/L為中毒，>10.0 mg/L為低毒。

本研究結(jié)果顯示，硫酸銅和辛硫磷對寬體金線蛭幼苗的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.241、0.493 mg/L，均屬高毒。高錳酸鉀的96 h半致死質(zhì)量濃度為2.313 mg/L，屬中毒。聚維酮碘的96 h半致死質(zhì)量濃度為56.058 mg/L，屬低毒。這4種藥物對寬體金線蛭幼苗的毒性依次為硫酸銅>辛硫磷>高錳酸鉀>聚維酮碘。

3.2 4種藥物在寬體金線蛭幼苗體內(nèi)的蓄積與降減的特征分析

藥物毒性蓄積程度系數(shù)常作為生物對毒物敏感程度差異的指示參數(shù)，來分析生物體對藥物的蓄積與降減動態(tài)[19]。其值越大，即毒效蓄積幅度越大，生物抗毒能力下降，致死率就越大；其值大于0時，蓄積作用強度大于降減作用，反之亦然。

由表3可知，硫酸銅和聚維酮碘的藥物毒性蓄積程度系數(shù)在24～48 h出現(xiàn)最大值，而高錳酸鉀和辛硫磷的藥物毒性蓄積程度系數(shù)值在48～72 h出現(xiàn)最大值，表明4種藥物的毒性分別在這兩個時間段在寬體金線蛭體內(nèi)蓄積作用較強，即為死亡高峰階段；過此階段后，藥物毒性蓄積程度系數(shù)出現(xiàn)下降，表明寬體金線蛭對藥物的抵抗能力上升，毒性減弱。通過比較4種藥物的藥物毒性蓄積程度系數(shù)，發(fā)現(xiàn)寬體金線蛭對高錳酸鉀在各試驗階段的蓄積幅度變化不大，表明其毒性蓄積較強，降解毒性能力較差；在試驗48～96 h寬體金線蛭對硫酸銅和辛硫磷的藥物毒性蓄積程度系數(shù)下降明顯，硫酸銅試驗72～96 h的藥物毒性蓄積程度系數(shù)是24～48 h的45.57%，辛硫磷試驗72～96 h的藥物毒性蓄積程度系數(shù)是24～48 h的20.36%，說明其降解毒效能力較強，毒效蓄積速度下降。因此，在研究藥物對動物的毒性效應(yīng)時，應(yīng)當(dāng)分析藥物毒性蓄積變化，充分考慮時效對其影響。

3.3 生產(chǎn)過程中幾種水產(chǎn)藥物的使用注意事項

硫酸銅是水產(chǎn)病害防治中的常用藥物，游離的銅離子能夠破壞氧化還原酶系統(tǒng)的活性，使酶失去活性而具有抗病原體的作用[20]。本試驗中硫酸銅對寬體金線蛭幼苗的安全質(zhì)量濃度為0.053 mg/L，遠低于常用劑量0.5 mg/L，重金屬銅離子易在體內(nèi)積累且溫度較高時毒性會加大，從而引起機體血液、生理生化及組織病理等變化[21]，因此建議禁止硫酸銅作為寬體金線蛭病害防治的藥物。

聚維酮碘為常用的消毒劑，是通過氧化病原體原漿蛋白的活性基因，并與蛋白的氨基結(jié)合而使其變性，從而有效殺死細菌、真菌、病毒及原蟲等病原體[22-23]。在水產(chǎn)苗種繁育過程中聚維酮碘的常用量為2～5 mg/L，本試驗中聚維酮碘對寬體金線蛭幼苗的安全質(zhì)量濃度為15.367 mg/L，大于常規(guī)劑量。因此聚維酮碘作為寬體金線蛭幼苗養(yǎng)殖過程中消毒劑可以安全使用。

高錳酸鉀是一種強氧化劑，通過釋放新生態(tài)氧，迅速氧化有機物，而起到殺菌、殺蟲的作用，常用于防治魚蝦等細菌、真菌和寄生蟲類疾病及設(shè)施、工具的消毒[24]。本試驗中高錳酸鉀對寬體金線蛭幼苗的安全質(zhì)量濃度為0.706 mg/L，小于生產(chǎn)上高錳酸鉀全池潑灑的劑量(1～2 mg/L)。因此，建議除對養(yǎng)殖設(shè)施和工具的消毒外，在寬體金線蛭培育過程中應(yīng)謹慎使用高錳酸鉀，如使用建議采用短時間浸泡方法，并注意用藥時間和觀察寬體金線蛭的行為。

辛硫磷是一種高效低毒的有機磷殺蟲劑，在防治寄生蟲性疾病中發(fā)揮重要作用，通過抑制膽堿脂酶活性，引起乙酰膽堿代謝紊亂，引起神經(jīng)中毒，常用劑量為10 μg/L[25]。然而，當(dāng)其劑量超過水產(chǎn)動物的安全用量時，會通過影響機體抗氧化系統(tǒng)干擾生物體的功能[26]。本研究結(jié)果顯示，辛硫磷對寬體金線蛭幼苗的安全質(zhì)量濃度為0.183 mg/L，高于常用劑量。因此，在常用劑量范圍內(nèi)，可以作為寬體金線蛭疾病防治的藥物。