基于Cytb和D-Loop的日本囊對蝦遺傳多樣性分析

杜景豪，王偉峰，陳秀荔，侯春秀，王煥嶺

( 1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070； 2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021 )

日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)屬甲殼綱、十足目、對蝦科、囊對蝦屬。日本囊對蝦的分布極其廣泛，在我國主要分布在長江口以南沿海，其具有耐低溫、生長快、營養(yǎng)高等特點(diǎn)，在我國對蝦養(yǎng)殖中具有較高的經(jīng)濟(jì)地位[1]。近年來，捕撈量的增加、養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大以及水域生態(tài)環(huán)境的惡化等，導(dǎo)致其自然資源不斷衰退。而遺傳變異水平與生物的生長速度、抗病能力等生產(chǎn)性狀密切相關(guān)[2]。因此開展日本囊對蝦的遺傳多樣性分析對其種質(zhì)資源保護(hù)與合理開發(fā)利用具有重要的意義。

線粒體DNA(mtDNA)是一種核外遺傳物質(zhì)，由于具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、母系遺傳及無組織特異性等特點(diǎn)[3]，而成為評估群體遺傳和生物進(jìn)化的有效標(biāo)記[4]。Tsoi等[5-6]曾利用mtDNA和微衛(wèi)星標(biāo)記研究西太平洋日本囊對蝦，發(fā)現(xiàn)其可以分成2個(gè)變種，并且都具有很高的遺傳多樣性。郭慧等[7-8]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對我國沿海3個(gè)日本囊對蝦群體遺傳多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同地理群體間具有不同程度的分化。

而動(dòng)物線粒體基因組中含細(xì)胞色素氧化酶3個(gè)亞基基因 (COⅠ、COⅡ、COⅢ)、細(xì)胞色素b(Cytb)、2個(gè)ATP酶亞基因(ATPase6、ATPase8)和7個(gè)NADH還原酶復(fù)合體亞基因共13個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因[9]。其中由于Cytb基因的進(jìn)化速度適中，諸多學(xué)者選擇其作為遺傳多樣性分析的標(biāo)記，用于分析種群母系起源、系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性等[10-13]。另外線粒體DNA控制區(qū)(D-Loop)處于非編碼區(qū)，富含A-T堿基，進(jìn)化速度較快，是揭示種群遺傳結(jié)構(gòu)常用的分子標(biāo)記[14-15]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)利用D-Loop序列進(jìn)行遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化研究信息更加全面，結(jié)果更為準(zhǔn)確[16-17]。因此，筆者基于Cytb和D-Loop序列，對我國日本囊對蝦遺傳多樣性展開研究，為日本囊對蝦種質(zhì)資源保護(hù)及合理利用和雜交育種的群體選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用日本囊對蝦于2018年8月—2019年3月分別采自浙江舟山、福建福州、福建廈門、廣西北海、廣東湛江5個(gè)近海水域，每個(gè)群體約20尾。所有樣品均取對蝦腹部第六腹節(jié)肌肉，于-20 ℃無水乙醇中保存。

1.2 基因組DNA的提取

取肌肉100～150 mg，采取SDS法[18]提取基因組DNA，使用超微量紫外分光光度計(jì)測定DNA質(zhì)量濃度并稀釋到150 ng/μL，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，于4 ℃保存。

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心中日本囊對蝦線粒體的基因組序列(序列號(hào):AP006346)設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增Cytb基因和D-Loop區(qū)。其中擴(kuò)增Cytb的引物序列為：Cb-L 5′-GGTCCTTTACG CTTATCATC-3′和Cb-R 5′-GGGTGAGTGGGTTAATAATG-3′；擴(kuò)增D-Loop的引物序列為：Dp-L 5′-ATTAGCACTAGGTACTGAGA-3′和Dp-R 5′-GGTAAGGCTTGACTTACATA-3′；由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成引物。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中雙蒸水15.2 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，DNA模板1.0 μL，左右引物各0.6 μL，dNTPs 0.3 μL，TaqDNA聚合酶0.3 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸75 s，共32個(gè)循環(huán)，最后72 ℃終延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Seqman軟件對比測序結(jié)果，并輔以人工校正；DnaSP[19]軟件統(tǒng)計(jì)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)、單倍型多態(tài)性、核苷酸多態(tài)性、多態(tài)簡約信息位點(diǎn)數(shù)、Fu和Li′sD檢驗(yàn)參數(shù)、Tajima′sD檢驗(yàn)參數(shù)；MEGA[20]軟件用于分析序列的平均堿基組成、轉(zhuǎn)換/顛換比率R、群體內(nèi)和群體間的遺傳距離以及系統(tǒng)發(fā)育樹[21]的構(gòu)建；Arlequin 3.1[22]軟件分析群體間及群體內(nèi)的遺傳變異和核苷酸錯(cuò)配分布情況。

2 結(jié) 果

2.1 堿基組成

測序結(jié)果經(jīng)過對比和校對后，分別選取長度1000 bp和900 bp的Cytb和D-Loop區(qū)用于后續(xù)分析。分析結(jié)果顯示，5個(gè)群體中Cytb和D-Loop序列的堿基顛換比值R(TS/TV)分別為6.267和2.694，突變以堿基的顛換為主。4種堿基在所得序列中平均含量A為24.77%和37.22%、T為35.88%和45.32%、C為24.07%和8.68%、G為15.28%和8.78%，其中A+T含量為60.65%和82.54%，顯著高于C+G含量(表1)，D-Loop序列較Cytb序列堿基組成更具偏倚性。

表1 日本囊對蝦5個(gè)群體Cytb和D-Loop序列堿基組成

2.2 遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

基于Cytb序列在5個(gè)群體中檢測到76個(gè)簡約信息位點(diǎn)，共定義了55種單倍型，其中Hap-30、Hap-36數(shù)量最多，均為10個(gè)，占樣本總數(shù)的10.1%；Hap-6數(shù)量為9個(gè)，占樣本總數(shù)9.1%；Hap-50、Hap-53數(shù)量均為4個(gè)，占樣本總數(shù)的4.1%；Hap-21、Hap-54數(shù)量均為3個(gè)，占樣本總數(shù)的3.1%；Hap-2、Hap-9、Hap-19、Hap-29、Hap-35、Hap-47、Hap-49、Hap-51數(shù)量均為2個(gè)，占樣本總數(shù)的2.1%；其他單倍型均只有1個(gè)(表2)。單倍型多態(tài)性為0.969，核苷酸多態(tài)性為0.033。群體內(nèi)遺傳距離為0.004～0.022，群體間遺傳距離為0.007～0.068，其中遺傳距離最大是舟山群體與北海群體，為0.068(表3)。基于D-Loop序列分析，在5個(gè)群體中發(fā)現(xiàn)了75個(gè)簡約信息位點(diǎn)，共定義了78種單倍型，其中Hap-22數(shù)量為4個(gè)，占樣本總數(shù)的4%；Hap-7、Hap-65數(shù)量均為3個(gè)，占樣本總數(shù)的3%；Hap-2、Hap-6、Hap-19、Hap-26、Hap-30、Hap-38、Hap-42和Hap-49數(shù)量均為2個(gè)，占樣本總數(shù)的2%；其余單倍型均為1個(gè)。單倍型多態(tài)性為0.995，核苷酸多態(tài)性為0.036。群體內(nèi)遺傳距離為0.005～0.017，群體間遺傳距離為0.012～0.075，其中遺傳距離最大是舟山群體與北海群體(0.075)(表4)。D-Loop序列中單倍型數(shù)、單倍型多態(tài)性及核苷酸多態(tài)性均高于Cytb序列，這表明D-Loop序列具有更高的遺傳多樣性，這可能與其進(jìn)化速度較快有關(guān)。

表4 基于D-Loop序列的群體內(nèi)及群體間遺傳距離

表3 基于Cytb序列的群體內(nèi)及群體間遺傳距離

表2 群體遺傳多樣性參數(shù)

分子方差分析結(jié)果顯示，基于Cytb和D-Loop序列獲得的群體內(nèi)變異貢獻(xiàn)率分別為29.99%和25.61%，群體間變異貢獻(xiàn)率達(dá)到70.01%和74.39%，可見群體間變異是變異的主要來源(表5)。遺傳分化指數(shù)(FST)常用于表示群體間的遺傳關(guān)系及分化程度，值越大表示群體分化程度越大[23]。兩者分化指數(shù)分別為0.7001和0.7439，表明群體間遺傳分化程度明顯。

表5 群體分子方差分析

2.3 單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

基于單倍型分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示(圖1)，不同群體間單倍型分化比較明顯，主要分化成兩個(gè)單系，即北海群體和湛江群體聚成一支，其他3個(gè)群體聚成另一支，同一單系間又有不同程度的分化，說明日本囊對蝦5個(gè)群體間存在比較明顯的地理譜系，種群間分化具有明顯的地域性。

圖1 基于Cytb(a)和D-Loop(b)序列單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 種群歷史動(dòng)態(tài)

中性檢驗(yàn)結(jié)果見表2，基于Cytb序列發(fā)現(xiàn)，北海、福州和舟山3個(gè)群體Fu′D值和Tajima′D值為負(fù)值，而其他2個(gè)群體Fu′D值和Tajima′D值為正值，表明北海、福州和舟山3個(gè)群體近期發(fā)生了種群擴(kuò)張，但總體未明顯偏離中性突變，種群存在平衡選擇，近期未出現(xiàn)明顯擴(kuò)張。基于D-Loop序列研究發(fā)現(xiàn)，5個(gè)群體Tajima′D值均為負(fù)值，總體 Tajima′D值為2.127，具有顯著性差異，表明各群體之間存在定向選擇，總體存在平衡選擇。而基于Cytb和D-Loop序列中性檢驗(yàn)值在5個(gè)群體內(nèi)具有差異性，可能是由于不同群體所處環(huán)境不同且D-Loop區(qū)更容易發(fā)生堿基突變。日本囊對蝦5個(gè)群體Cytb和D-Loop區(qū)核苷酸錯(cuò)配分布見圖2，兩者成多峰分布，表明整個(gè)種群保持相對穩(wěn)定，近期未曾經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)和明顯擴(kuò)張。

圖2 群體Cytb(a)和D-Loop(b)核苷酸錯(cuò)配分布

3 討 論

3.1 序列堿基組成分析

本研究基于線粒體Cytb和D-Loop序列對我國沿海5個(gè)日本囊對蝦群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)4種堿基出現(xiàn)明顯的偏隨機(jī)分布，即A+T含量顯著高于C+G含量，符合節(jié)肢動(dòng)物mtDNA堿基組成中G+C含量相對缺乏，A+T含量高的普遍現(xiàn)象[24]。曾凡榮等[25]基于日本囊對蝦線粒體Cytb的研究發(fā)現(xiàn)，A+T含量高達(dá)59.4%，與本研究相關(guān)結(jié)果基本相符。利用顛換比值R，可以估計(jì)序列的飽和度，R>5表示序列未達(dá)到飽和，一般來說分歧時(shí)間越長、親緣關(guān)系越遠(yuǎn)的群體間堿基發(fā)生顛換的頻率越高，即R值越小，由此可初步判斷群體間的進(jìn)化關(guān)系[26]。Cytb和D-Loop區(qū)堿基顛換比值R分別為5.970和2.694，說明Cytb突變未達(dá)到飽和而D-Loop區(qū)突變可能已達(dá)到飽和，兩者均產(chǎn)生了一定程度的進(jìn)化。

3.2 群體遺傳多樣性與遺傳分化分析

遺傳多樣性即基因多樣性，存在于生物個(gè)體內(nèi)、單個(gè)物種內(nèi)以及物種間，是生物適應(yīng)和進(jìn)化的基礎(chǔ)，種內(nèi)的遺傳多樣性與該物種對環(huán)境的適應(yīng)能力呈正向線性關(guān)系[27]。物種遺傳多樣性的分布不僅受到現(xiàn)階段演化力量(如遷移)的影響, 還受到歷史的影響，生活環(huán)境的不連續(xù)性和種群數(shù)量變動(dòng)的不穩(wěn)定，均會(huì)造成種群間的分化[28]。劉若余等[29]研究表明，線粒體DNA的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性是衡量群體遺傳多樣性和遺傳分化的重要指標(biāo)，兩者數(shù)值越大，群體遺傳多樣性越高。本研究從Cytb和D-Loop區(qū)兩個(gè)角度分析發(fā)現(xiàn)，兩者的單倍型多態(tài)性分別為0.969和0.995，核苷酸多態(tài)性為0.033和0.036，這說明我國沿海5個(gè)日本囊對蝦群體遺傳多樣性處于較高的水平。Tzeng等[30]研究日本囊對蝦線粒體控制區(qū)發(fā)現(xiàn)，東亞地區(qū)日本囊對蝦具有很高的遺傳多樣性，與本研究的結(jié)果基本相符。

從遺傳距離來看，物種內(nèi)的遺傳距離通常小于10%[31]。大于6%的群體間會(huì)有明顯的亞種或者種的分化[32-33]，不論是從Cytb或D-Loop來衡量，北海群體和湛江群體與其他3個(gè)群體遺傳距離均較遠(yuǎn)，接近亞種的分化水平，可能由于不同群體間地理位置相距較遠(yuǎn)，阻礙了群體間基因交流?；贑ytb和D-Loop序列分子方差分析顯示，群體間變異是總變異的主要來源。而曾凡榮等[25]基于Cytb基因的研究也發(fā)現(xiàn)，日本囊對蝦群體間遺傳變異占69.9%。據(jù)溯祖理論[34]，Cytb中單倍型Hap-30和Hap-36數(shù)量最多可能為祖先類型，而D-Loop區(qū)單倍型Hap-22可能為祖先類型。D-Loop區(qū)單倍型分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)群體間共享單倍型較少，群體分化十分明顯，這與Cytb基因分析結(jié)果有所不同，可能是由于D-Loop區(qū)受到的選擇壓力小，進(jìn)化速度較快，而Cytb是編碼蛋白質(zhì)的功能基因，受到的選擇壓力較大，進(jìn)而導(dǎo)致Cytb和D-Loop的變異存在不均一性[35]?；贑ytb和D-Loop序列單倍型進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，各群體特有單倍型基本聚在一起，部分存在交叉的現(xiàn)象，可能是群體間的部分個(gè)體在自然生長過程中遺傳背景存在交叉[36-37]?；贑ytb和D-Loop序列分析發(fā)現(xiàn)，D-Loop進(jìn)化速度要高于Cytb，遺傳多樣性更加豐富，相對更加接近分子鐘假說。因此，D-Loop比Cytb更加適合于研究日本囊對蝦群體遺傳多樣性的分子標(biāo)記。

由種群的錯(cuò)配分布圖可見，種群呈多峰分布，表明種群近期未曾經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)和明顯擴(kuò)張[38]，保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，自然選擇將突變保持在平衡水平。此外，日本囊對蝦產(chǎn)卵洄游并不是特別明顯，僅隨個(gè)體生長由近岸向遠(yuǎn)岸遷移，這樣地理距離相距較近的群體更容易發(fā)生基因交流。氣候急劇變化會(huì)引起群體數(shù)量突然減少，可能導(dǎo)致種群遺傳多樣性差異，而洋流、遷徙和人類活動(dòng)會(huì)促進(jìn)不同群體間的基因交流而減少分化[39-40]。

本研究通過日本囊對蝦不同地理種群的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，我國日本囊對蝦群體具有較高的遺傳多樣性，野生資源狀況良好，為日本囊對蝦的種質(zhì)資源保護(hù)工作提供科學(xué)依據(jù)，也為雜交育種的群體選擇提供參考資料。