飼糧添加陳化玉米和復合抗氧化劑對仔豬生長性能、抗氧化功能及肝臟損傷的影響

李錦英，陳代文，鄭 萍，虞 潔，毛湘冰，何 軍，黃志清，羅玉衡，羅鈞秋，余 冰

（動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，成都611130）

近年來我國玉米產(chǎn)量大幅度上升，產(chǎn)量的百分之七十左右用于飼料生產(chǎn)，剩余部分主要歸入倉庫臨儲，且伴隨產(chǎn)量的增加，臨儲總量也隨之上漲。我國糧食儲備具有規(guī)模大和年限長兩大特點，其輪換和代儲的平均年限為3年[1]。如何合理高效利用儲存期長的輪換玉米非常重要。前人研究表明，伴隨玉米儲存時間的延長，其理化性質(zhì)會發(fā)生不同程度的劣化。研究發(fā)現(xiàn)，陳化玉米相較于正常玉米在水分、粗蛋白質(zhì)和灰分[1]等養(yǎng)分含量上變化不顯著，但儲存時間長的玉米，其α-淀粉酶[2]、過氧化物酶（POD）[3]和過氧化氫酶（CAT）[4]的酶活顯著下降，且胚芽部富含的多不飽和脂肪酸易發(fā)生氧化酸敗[5]，產(chǎn)生過量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛[6]。我國GB/T20570-2015中規(guī)定玉米宜存脂肪酸值（FAV）≤65 mg/100 g，重度不宜存FAV值＞78 mg/100g[7]。因脂質(zhì)的氧化與水解，導致陳化玉米的FAV值上升[8]，且單個揮發(fā)性物質(zhì)如乙酸、己醛等及總揮發(fā)性物質(zhì)含量增加[9]。儲存條件良好的陳化玉米其霉菌毒素含量一般不超過國家和歐盟標準[10]，但儲存不當也會導致霉菌毒素的顯著增加。有研究表明，畜禽飼糧中使用陳化玉米會影響生產(chǎn)性能。2016—2017年上半年，我國部分飼料企業(yè)因在飼料配方中采用陳化玉米而引發(fā)區(qū)域性黃膘肉現(xiàn)象，且豬的采食量下降、生產(chǎn)性能降低[11]。劉比一等發(fā)現(xiàn)肉雞采食儲存期長的玉米，血清抗氧化功能顯著下降[12]，可能破壞肝臟結(jié)構(gòu)，引發(fā)炎癥反應[13]。張亞茹等發(fā)現(xiàn)陳化玉米飼糧中添加維生素E、茶多酚等抗氧化劑，可不同程度地改善肉鴨的抗氧化能力[14]。目前，關于維生素C、維生素E、酵母硒等的抗氧化作用已進行了大量研究，其抗氧化作用已經(jīng)很明確，且復合使用時具有協(xié)同效果。目前，關于陳化玉米在畜禽上使用效果的研究主要集中在家禽上，就已發(fā)表的文獻看，尚無有關陳化玉米在仔豬上的研究報道，其對仔豬生長性能和抗氧化能力的影響尚不清楚。同時，在含陳化玉米的仔豬飼糧中添加抗氧化劑能否緩解陳化玉米的可能負面效應也不清楚。因此，本研究旨在用儲藏4年的陳化玉米不同比例替代飼糧中的正常玉米，初步探究陳化玉米對仔豬生長性能、抗氧化能力及肝臟結(jié)構(gòu)和功能的可能影響以及復合抗氧化劑的添加效應，研究結(jié)果可為養(yǎng)殖生產(chǎn)中合理使用陳化玉米作為畜禽飼料原料積累試驗資料。

1 材料和方法

1.1 試驗時間和地點

動物飼養(yǎng)試驗于2017年2—3月在四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所科研基地仔豬代謝舍進行。

1.2 試驗材料

本試驗中普通玉米儲存時間為1年，購自四川旺達飼料有限公司，顏色金黃，顆粒飽滿且完整粒高；陳化玉米儲存時間為4年，購自東北周邊糧庫，色澤暗淡，顆粒較飽滿且完整粒低。其儲存條件遵從GB/T 7415—2008標準。

1.3 試驗設計與試驗動物

選擇24頭體重相近為（7.24±0.02）kg的健康DLY斷奶仔豬，按體重相近和公母各半原則隨機分為4個處理（每個處理6個重復，每個重復1頭仔豬），分別飼喂基礎飼糧（玉米為正常）、陳化玉米50飼糧（陳化玉米50%替代基礎飼糧玉米）、陳化玉米100飼糧（陳化玉米100%替代基礎飼糧玉米）、復合抗氧劑飼糧（陳化玉米100飼糧+0.2%復合抗氧化劑）。試驗期28 d。試豬全程單籠飼養(yǎng)。

1.4 試驗飼糧

基礎飼糧由玉米、豆粕、膨化大豆、魚粉等組成，參照NRC（2012）7～11 kg和11～25 kg仔豬營養(yǎng)需要進行配制，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。據(jù)試驗設計用陳化玉米替代基礎飼糧中相應比例的正常玉米即構(gòu)成試驗飼糧。復合抗氧化劑以等量替代基礎飼糧中的球磨糠。

復合抗氧化劑組成：參考李彥等[15]和高億清等[16]的研究結(jié)果，制定復合抗氧化劑組成如下：0.3 mg/kg酵母硒（純度＞95%）、100 mg/kg維生素E（純度＞95%）、200 mg/kg維生素C（純度＞95%）。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis)%

1.5 飼養(yǎng)管理

試驗期間仔豬日飼喂3次（8:00，14:00，20:00），每次喂料采取濕拌料，以手捏成團但不出水為宜，量以吃飽后飼槽內(nèi)略有余料為度，自由飲水。室溫保持在26℃左右。每天打掃圈舍衛(wèi)生。定期帶豬消毒。

1.6 樣品采集與處理

1.6.1 飼料樣

將陳化玉米和正常玉米原料及各處理組全價配合飼料嚴格按四分法原則取200～300 g置于已知重量的瓷盤中，65℃烘干達恒重后粉碎，過40目篩，-20℃保存待測。

1.6.2 血清樣

所有試驗仔豬試驗第28天晚20:00禁食12 h后，于試驗第29天早8:00進行前腔靜脈采血30 mL，室溫下傾斜靜置30 min后3,500 r/min離心10 min，分離血清，分裝后-20℃保存待測。

1.6.3 肝臟樣

試驗第29天早上采血后，所有試驗豬麻醉后迅速打開胸腔，取肝臟樣，用預冷生理鹽水沖洗血漬，濾紙吸干多余水分后分裝，液氮速凍后-80℃保存待測。

1.7 考察指標與方法

1.7.1 玉米和飼糧生化特性指標

玉米和飼糧中POD和CAT活性及MDA含量采用分光光度比色法測定。所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，詳細操作方法參見試劑盒說明書。FAV按照SC/T3501—1996方法檢測；常規(guī)概略養(yǎng)分含量按照張麗英[17]方法測定。

1.7.2 生長性能

試驗期間準確記錄每個重復每日采食量，并于試驗的第1天和第29天早上對仔豬進行空腹稱重，計算試豬的ADG、ADFI和F/G。

1.7.3 血清轉(zhuǎn)氨酶及氧化還原相關指標

血清GPT和GOT活性，T-AOC，CAT、T-SOD和GSH-Px活性，MDA含量采用分光光度比色法測定。所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，詳細操作方法參見試劑盒說明書。

1.7.4 抗氧化指標測定

肝臟中CAT、T-SOD和GSH-Px活性，MDA、還原型谷胱甘肽（GSH）和PCO含量的測定采用分光光度比色法測定，所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，詳細操作方法參見試劑盒說明書。DNA氧化產(chǎn)物8-OHdG采用ELISA法檢測，試劑盒購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司。

1.7.5 肝臟炎性和凋亡相關基因mRNA表達量

采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RTPCR）技術測定肝臟炎性和凋亡相關基因相對表達量。組織中總RNA的提取和質(zhì)量檢測參照Chen Y.等[18]的方法進行。cDNA的合成按照RT Reagent kit的說明書進行。待測基因引物序列由大連生物科技有限公司合成，引物序列見表2。用實時定量PCR儀（ABI-7900）進行測定，RT-PCR反應體系為10μL：SYBR Premix ExTaqTMⅡ（TaKaRa，Japan）5μL，上下游引物各0.4μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.2μL。PCR擴增條件為：模板預變性，95℃，30 s；擴增，95℃，10 s；適宜的退火溫度（表2），25 s，共39個循環(huán)；溶解曲線，55～95℃，溫度以0.5℃/s速率提升。各目的基因的相對表達量以β-actin作為內(nèi)參基因進行計算，計算方法參考T.D.Schmittgen等[19]。每個樣品設定3個平行，取平均值用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SAS8.1統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。采用一般線性模型（general linear model，GLM）對CTL組、AG50組和AG100組相關指標進行單因素方差分析，差異顯著時采用Duncan法進行多重比較；對AG100組和AG100-AO組相關指標進行t檢驗。所有結(jié)果以“平均數(shù)±標準誤”表示，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米和飼糧的生化特性

由表3可知，陳化玉米與正常玉米的水分、粗灰分、粗脂肪及粗蛋白質(zhì)等概略養(yǎng)分含量無顯著差異。但是，陳化玉米的CAT和POD酶活分別比正常玉米降低40.33%和47.24%，F(xiàn)AV和MDA含量分別為正常玉米的1.94倍和20.41倍。

表2 基因引物序列Table 2 Primer sequences of target and reference genes

表3 普通正常玉米和陳化玉米生化特性Table 3 The biochemical property of normal corn and aging corn

由表4可知，隨著飼糧中陳化玉米替代比例的增加，與基礎飼糧相比，含陳化玉米的飼糧其CAT和POD活性降低，而FAV增加。

2.2 陳化玉米和復合添加劑對仔豬生長性能的影響

由表5可知，與CTL組相比，AG50組和AG100組均顯著降低仔豬ADFI（P＜0.05），ADG分別降低8.78%和7.37%，F(xiàn)/G分別降低4.83%和4.12%，但差異均不顯著（P＞0.05）。與AG100組相比，添加復合抗氧劑能一定程度緩解陳化玉米導致的ADFI和ADG的下降，但差異不顯著（P＞0.05）。

表4 飼糧抗氧化酶活和脂肪酸價Table 4 The activities of dietary antioxidant enzymes and fatty acid value

表5 陳化玉米和復合抗氧化劑對仔豬生長性能的影響Table 5 Effects of aging corn and complex antioxidant supplementation on the growth performance of piglets

2.3 陳化玉米和復合添加劑對仔豬抗氧化功能的影響

由表6可知，與CTL組相比AG50組和AG100組顯著降低仔豬血清GSH-Px活性（P＜0.01），且AG100組顯著降低T-AOC水平（P＜0.01）；添加陳化玉米不同程度降低血清CAT和T-SOD活性，但差異不顯著（P＞0.05）。與陳化玉米100組相比，復合抗氧化劑顯著提高血清CAT、T-AOC活性和肝臟GSH含量（P＜0.05）。

2.4 陳化玉米和復合添加劑對仔豬肝臟氧化損傷的影響

由表7可知，與CTL組相比，AG50組和AG100組顯著提高肝臟8-OHdG含量（P＜0.05）。與AG100組相比，復合抗氧劑顯著降低肝臟MDA、8-OHdG和PCO含量（P＜0.05）。

添加陳化玉米不同程度提高GPT活性，差異不顯著，但AG50組和AG100組GOT/GPT值分別降低21.82%（P＞0.05）和46.67%（P＜0.05）。與AG100組相比，復合抗氧化劑使GOT活性增加21.95%（P＞0.05），GPT活性降低28.90%（P＜0.05），GOT/GPT值升高125%（P＜0.01）。

2.5 陳化玉米和復合添加劑對仔豬肝臟細胞因子和凋亡相關分子表達的影響

由表8可知，添加陳化玉米和復合抗氧化劑均對仔豬肝臟促炎性相關因子TNF-α、IL-1β、NFκB、IL-6和抗炎因子IL-10 mRNA豐度，及促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl2mRNA豐度均無顯著影響。

3 討論

3.1 陳化玉米的理化特性

研究表明，隨著玉米儲存時間的延長，相較于正常玉米，其水分、粗蛋白質(zhì)和灰分等常規(guī)養(yǎng)分含量的變化不顯著，但α-淀粉酶、CAT及POD的酶活顯著下降，且玉米胚芽部富含的多不飽和脂肪酸易發(fā)生氧化酸敗，產(chǎn)生過量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA[1-6]。脂質(zhì)的氧化與水解也將導致陳化玉米的FAV上升[8]。本試驗研究結(jié)果與前人相似，陳化玉米的概略養(yǎng)分含量變化不大，但CAT與POD的酶活大幅降低，而FAV大幅升高，嘔吐毒素含量相對較高；且各處理組飼糧呈現(xiàn)類似變化規(guī)律。前人研究表明，當多種霉菌毒素同時存在時會協(xié)同霉菌毒素的負面效應，因而也可能會影響仔豬的采食量。因此，上述結(jié)果暗示，陳化玉米呈現(xiàn)脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象及多種霉菌毒素同時污染（雖未超標），將其用作飼料原料時可能會表現(xiàn)負面效應。

表6 陳化玉米及復合抗氧化劑對仔豬血清和肝臟抗氧化指標的影響Table 6 Effects of aging corn and complex antioxidant supplementation on serum and liver anti-oxidation index of piglets

表7 陳化玉米及復合抗氧化劑對仔豬肝臟損傷指標的影響Table 7 Effects of aging corn and complex antioxidant supplementation on hepatic oxidative injury in piglets

表8 陳化玉米及復合抗氧化劑對仔豬肝臟炎性與凋亡因子mRNA表達水平的影響Table 8 Effects of aging corn and complex antioxidant supplementation on mRNA abundance of inflammatory and apoptotic factors in liver of piglets

3.2 陳化玉米和復合抗氧化劑對仔豬生長性能的影響

2016—2017年上半年，我國部分飼料企業(yè)因在飼料配方中采用陳化玉米而引發(fā)區(qū)域性黃膘肉現(xiàn)象，且豬的采食量下降、生產(chǎn)性能降低[11]。Yin D.F.[20]等飼喂肉雞陳化玉米飼糧，發(fā)現(xiàn)ADG和F/G顯著降低。崔小燕等[21]研究表明與0年和1年的玉米相比，飼喂儲存4年的玉米顯著降低了1～21日齡肉雞F/G。本試驗發(fā)現(xiàn)，陳化玉米替代組顯著降低仔豬采食量，對ADG和F/G無顯著影響。原因可能有如下兩個方面：第一，動物模型不同對陳化玉米的反應敏感性不同，本試驗以斷奶仔豬為動物模型，而此前報道中的動物模型多為家禽；第二，ADG降低不顯著可能與試驗時間短，樣本量小有關。張亞茹等[14]在儲存3年玉米中添加茶多酚和維生素E作為強效的抗氧化劑能提高采食陳化玉米肉鴨的生長性能。本試驗未發(fā)現(xiàn)陳化玉米組添加復合抗氧化劑對仔豬ADFI、ADG和F/G的影響，原因可能與試驗期相對較短，陳化玉米脂肪過氧化等特性尚未顯著引發(fā)仔豬的病理變化，導致復合抗化劑在生長性能方面無顯著作用。

3.3 陳化玉米和復合抗氧化劑對仔豬血清抗氧化指標的影響

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的自由基（ROS）可引起細胞膜脂質(zhì)過氧化反應[22]，產(chǎn)生的終產(chǎn)物MDA可與蛋白質(zhì)、DNA等交聯(lián)，使蛋白質(zhì)活性發(fā)生改變，并損傷DNA，誘導基因突變等[23]。ROS可與生物體內(nèi)的一些天然的自由基清除劑或抗氧化劑反應而終止連鎖反應[24]。生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)包括酶促防御系和非酶促反應，兩者能有效清除胞外源和內(nèi)源的氧自由基，維護機體抗氧化功能。劉比一等[12]發(fā)現(xiàn)儲存期長的玉米會損傷肉雞血清抗氧化功能。鞠雪[25]等研究草魚攝食氧化魚油飼料導致血清及組織抗氧化酶活下降。本試驗結(jié)果與前人相似，表明陳化玉米飼糧可能導致機體抗氧化能力下降。王顯慧[26]等在肉雞飼糧中添加維生素C、維生素E均顯著提高血清抗氧化酶活性。張亞茹等在陳化玉米飼糧中添加維生素E、茶多酚等抗氧化劑，發(fā)現(xiàn)抗氧化劑可不同程度地改善機體抗氧化能力[13]。本試驗添加復合抗氧化劑可能改善陳化玉米組仔豬機體的抗氧化功能。

3.4 陳化玉米和復合抗氧化劑對仔豬肝臟的影響

肝臟具有解毒、免疫、凝血及膽汁生成與排泄等功能，其結(jié)構(gòu)功能的正常對豬的生長健康起著重要作用。王永慶[27]發(fā)現(xiàn)飼料中添加氧化油脂可能對團頭魴肝臟組織結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)合成功能造成損傷。A.Ammouche[28]等飼喂氧化葵花籽油可以改變大鼠肝臟脂肪酸的組成，甚至會出現(xiàn)僅存在于氧化油脂中的反式脂肪酸。A.Kode[29]研究表明，加熱氧化的葵花油會導致大鼠肝臟磷脂脂肪酸組成發(fā)生劇烈變化，細胞膜流動性變強。孫得發(fā)[11]等發(fā)現(xiàn)生長育肥豬采食陳化玉米飼糧后，肝臟發(fā)生腫大現(xiàn)象。崔小燕[10]飼喂儲存期長的玉米顯著降低了雞肝臟GSH-Px活性和GSH含量。本試驗未發(fā)現(xiàn)陳化玉米飼糧組對仔豬肝臟抗氧化酶活的影響，原因可能與試驗期較短有關。復合抗氧化劑的添加可顯著提高仔豬肝臟GSH含量，表明復合抗氧化劑能改善仔豬肝臟抗氧化功能。陳科全等[30]研究表明飼料中MDA可顯著升高血清GPT的含量。本試驗結(jié)果與前人相似，表明陳化玉米可能通過升高血清GPT對肝臟功能造成影響。飼糧MDA含量不僅會引起機體脂質(zhì)過氧化損傷，同時又可與蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)、互作[31-32]，造成機體蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷。本試驗中AG50組和AG100組顯著提高肝臟8-OHdG水平，添加復合抗氧化劑顯著提高仔豬肝臟GSH含量，顯著降低肝臟其他氧化損傷產(chǎn)物含量。以上結(jié)果表明，陳化玉米可降低仔豬機體抗氧化能力，且造成不同程度的氧化損傷，且相對于直接在飼糧中直接添加氧化魚油或MDA而言，陳化玉米中所含MDA的量相對低，且以玉米為外在載體，對機體的應激效果可能不及直接添加該物質(zhì)，且病理現(xiàn)象的發(fā)生是一個長期沉積的過程。前人報道育肥豬飼料中采用陳化玉米引起黃膘肉現(xiàn)象，這可能就是一個長期存積的效果。本試驗短期飼喂雖并未發(fā)現(xiàn)其對仔豬生長性能及抗氧化能力和肝功能等造成顯著損傷，但是已經(jīng)顯著降低仔豬采食量，導致機體抗氧化功能的下降和肝臟的氧化損傷，這對仔豬后期的生長發(fā)育與健康實際已經(jīng)帶來隱患；添加復合抗氧化劑能一定程度上改善仔豬機體抗氧化能力并緩解機體受到的氧化損傷。該結(jié)果為陳化玉米用作畜禽飼料原料的合理使用積累了試驗依據(jù)。

此外，研究發(fā)現(xiàn)陳化玉米可能會破壞肉雞肝臟的組織結(jié)構(gòu)并引起炎性反應[13]。在病理狀態(tài)下，自由基是致炎介質(zhì)，能激活NF-κB和調(diào)節(jié)炎癥相關因子[33]。本試驗發(fā)現(xiàn)陳化玉米添加組不顯著影響肝臟炎性因和凋亡因子mRNA的表達豐度；復合抗氧化劑的添加也無顯著作用。表明短期內(nèi)陳化玉米對仔豬肝臟的炎性損傷和細胞凋亡無顯著影響。

4 結(jié)論

本試驗條件下，與正常玉米相比，陳化玉米中CAT、POD酶活下降，F(xiàn)AV、MDA含量上升。飼糧添加陳化玉米顯著降低仔豬ADFI，對ADG和F/G無顯著影響，導致機體抗氧化功能的下降和肝臟的氧化損傷。添加0.2%復合抗氧化劑一定程度改善機體抗氧化能力，緩解陳化玉米導致的肝臟氧化損傷。