甘露寡糖對(duì)泥鰍生產(chǎn)性能、腸道菌群和非特異性免疫功能的影響

杜宗君，蘇 健，巫紅萍，王雪力，鄧 濤，曾麗雯，徐華明，武佳韻，溫安祥*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安625014）

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）屬溫水性底棲小型魚類，具有較好的食用和藥用價(jià)值。國(guó)內(nèi)外旺盛的市場(chǎng)需求，促進(jìn)了泥鰍養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。但泥鰍生長(zhǎng)速度相對(duì)緩慢，苗種成活率低。高密度養(yǎng)殖引起的應(yīng)激反應(yīng)也導(dǎo)致魚體抗病力下降。為防控病害，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中普遍使用抗生素，由此產(chǎn)生的抗藥性和藥物殘留等食品安全問題已引起人們的高度重視。研發(fā)綠色無(wú)毒、低成本的高效促生長(zhǎng)劑或免疫增強(qiáng)劑，提高泥鰍的生長(zhǎng)速度和成活率，減少抗生素的使用，已成為推動(dòng)泥鰍養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要舉措之一。

甘露寡糖（mannose oligosaccharides,MOS）是一種從酵母細(xì)胞壁中提取的磷酸化葡萄糖與甘露糖結(jié)合的復(fù)合物，具有無(wú)毒副作用、無(wú)污染殘留、不產(chǎn)生耐藥性且可部分替代抗生素等特點(diǎn)。已有研究表明，甘露寡糖可提高非洲鯰魚[1]、鯉魚[2-5]、大西洋鮭[6]、羅非魚[7-8]、金頭鯛[9]、黃顙魚[10]、斑點(diǎn)叉尾鮰[11]、舌齒鱸[12]和草魚[13]等魚類的生產(chǎn)性能和抗病力[14]。但李富東[15]的相關(guān)研究中卻發(fā)現(xiàn)甘露寡糖對(duì)牙鲆的生產(chǎn)性能、消化酶、血清溶菌酶活力和白細(xì)胞吞噬活性均沒有顯著影響。徐磊等[16]的研究表明甘露寡糖對(duì)異育銀鯽的生產(chǎn)性能影響不明顯，但能顯著提高異育銀鯽血清堿性磷酸酶活性、球蛋白濃度和總抗氧化能力，增強(qiáng)其對(duì)嗜水氣單胞菌感染的免疫保護(hù)。迄今未見甘露寡糖對(duì)泥鰍生產(chǎn)性能和免疫功能的研究報(bào)道。本試驗(yàn)擬探索在飼料中添加甘露寡糖對(duì)泥鰍生產(chǎn)性能、腸道菌群和非特異性免疫功能的影響，以期為泥鰍健康養(yǎng)殖實(shí)踐中科學(xué)利用甘露寡糖提供參考，同時(shí)為進(jìn)一步探索甘露寡糖的作用機(jī)理提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)?zāi)圉q購(gòu)自四川省成都市雙流縣萬(wàn)福水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。將購(gòu)回的魚種用1.5% NaCl消毒10 min，飼養(yǎng)于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)所用基礎(chǔ)飼料配方見表1。常規(guī)飼料原料購(gòu)自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所，預(yù)混料購(gòu)自廣州白云牧之林動(dòng)物藥廠。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)14 d，選擇初重為（3.27±0.05）g的健壯泥鰍360尾，隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾，置于60 cm×45 cm×45 cm的玻璃缸中飼養(yǎng)。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、100、200、400、600和800 mg/kg甘露寡糖（四川成都禾日生物科技有限公司，飼料級(jí)，干基≥70%），配制成6種飼料。微量組分采用逐級(jí)擴(kuò)大法加入基礎(chǔ)飼料。用水將飼料揉和成團(tuán)，每天按魚體重的2%～3%定時(shí)（09:00、18:00）投喂。每次投喂前采用虹吸法清除殘餌，并補(bǔ)充適量新水。試驗(yàn)期水深20 cm，水溫為22～28℃，室內(nèi)自然光照。試驗(yàn)期70 d。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)禁食24 h，測(cè)定泥鰍的體長(zhǎng)和體重；從每一重復(fù)中隨機(jī)撈取10尾泥鰍，自尾靜脈采血，0.5%肝素鈉抗凝。將每2尾泥鰍的抗凝血等量混合，4℃下3 000 r/min離心10 min制備血漿。解剖并迅速分離肝胰臟，與預(yù)冷0.65% NaCl溶液按1∶9體積比混合，4℃下勻漿，將勻漿液3 000 r/min離心10 min，取上清液。測(cè)量腸道長(zhǎng)度，稱取腸道重量，收集腸道內(nèi)容物。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生產(chǎn)性能測(cè)定

成活率（SR）=終末尾數(shù)/初始尾數(shù)×100%

特定生長(zhǎng)率（SGR）=（ln終末體質(zhì)量-ln初始體質(zhì)量）/試驗(yàn)天數(shù)×100%

肥滿度（CF）=體重/體長(zhǎng)3×100%

餌料系數(shù)（FCR）=投食飼料總質(zhì)量/（終末體質(zhì)量-初始體質(zhì)量）

腸體指數(shù)（IWI）=腸重/體重×100%

腸長(zhǎng)指數(shù)（ILI）=腸長(zhǎng)/體長(zhǎng)×100%

1.4.2 腸道菌群檢測(cè)

采用點(diǎn)種法檢測(cè)腸道大腸埃希菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌[17]。將腸道內(nèi)容物以滅菌生理鹽水倍比稀釋為10-1～10-6，然后用微量進(jìn)樣器分別取稀釋液0.02 mL，滴入各種培養(yǎng)基，即大腸埃希菌用伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB），乳酸桿菌用MRS培養(yǎng)基，雙歧桿菌MRS+X-gal培養(yǎng)基。每個(gè)重復(fù)做3個(gè)稀釋度（大腸埃希菌選擇10-3、10-4、10-5；乳酸桿菌選擇10-4、10-5、10-6；雙歧桿菌選擇10-4、10-5、10-6），每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。大腸埃希菌需氧培養(yǎng)24 h，乳酸桿菌、雙歧桿菌厭氧培養(yǎng)72 h，分別計(jì)數(shù)大腸埃希菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量。菌群數(shù)量以每克腸道內(nèi)容物所含細(xì)菌群落總數(shù)的對(duì)數(shù)[（lg CFU）/g]表示。

1.4.3 非特異性免疫指標(biāo)測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)溶菌酶（lysozyme，LZM）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等非特異性免疫指標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)，先對(duì)數(shù)據(jù)作單因數(shù)方差分析（ANOVA），若組間差異顯著，再用Ducans多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露寡糖對(duì)泥鰍生產(chǎn)性能的影響

據(jù)表2所示，100～600 mg/kg組泥鰍的特定生長(zhǎng)率顯著高于對(duì)照組和800 mg/kg組（P＜0.05）；100～800 mg/kg組泥鰍的肥滿度均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中200 mg/kg組最高；200和400 mg/kg組的餌料系數(shù)顯著低于對(duì)照組、100、600和800 mg/kg組；各試驗(yàn)組泥鰍的成活率與對(duì)照組相比均有所提高，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 甘露寡糖對(duì)泥鰍生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effect of mannan-oligosaccharides on production performance of M.anguillicaudatus

2.2 甘露寡糖對(duì)泥鰍腸道發(fā)育和腸道主要菌群的影響

從表3可知，添加甘露寡糖的各試驗(yàn)組泥鰍的腸體指數(shù)和腸長(zhǎng)指數(shù)均顯著大于對(duì)照組（P＜0.05），其中200 mg/kg組的腸體指數(shù)和腸長(zhǎng)指數(shù)最大；200～800 mg/kg組大腸埃希菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；各甘露寡糖組泥鰍的腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量均顯著大于對(duì)照組（P＜0.05），其中200～600 mg/kg組乳酸桿菌數(shù)量顯著高于低添加劑量的100 mg/kg組和高添加劑量的800 mg/kg組（P＜0.05），200～400 mg/kg組雙歧桿菌數(shù)量顯著高于低添加劑量的100 mg/kg組和高添加劑量的600 mg/kg組、800 mg/kg組（P＜0.05）。

2.3 甘露寡糖對(duì)泥鰍非特異性免疫的影響

添加甘露寡糖對(duì)泥鰍血漿和肝胰臟SOD、CAT及LZM等非特異性免疫指標(biāo)的影響見表4。肝胰臟和血漿SOD、CAT活性，以及血漿LZM含量均隨甘露寡糖添加量地增加而提高，添加200 mg/kg或400 mg/kg時(shí)達(dá)到最高水平。200 mg/kg組、400 mg/kg組血漿和肝胰臟SOD、CAT活力較對(duì)照組顯著提高（P＜0.05）。各甘露寡糖組血漿LZM含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表3 甘露寡糖對(duì)泥鰍腸道發(fā)育和腸道主要菌群的影響Table 3 Effects of mannan-oligosaccharides on intestinal development and intestinal microflora in M.anguillicaudatus

表4 甘露寡糖對(duì)泥鰍血漿和肝胰臟SOD、CAT及LZM的影響Table 4 Effects of mannan-oligosaccharides on SOD，CAT and LZM in plasma and hepatopancreas of M.anguillicaudatus

3 討論

3.1 甘露寡糖對(duì)泥鰍生產(chǎn)性能和腸道菌群的影響

自T.Yoshida等[1]率先報(bào)道甘露寡糖能顯著提高大西洋鮭抗病力以來(lái)，有關(guān)甘露寡糖對(duì)魚類生長(zhǎng)性能和腸道菌群影響的研究也陸續(xù)開展。李云蘭[2]、李洋[5]等添加甘露寡糖顯著提高幼建鯉的增重率、降低餌料系數(shù)，顯著提高腸道重量與長(zhǎng)度、腸道乳酸桿菌與雙歧桿菌數(shù)量，降低大腸埃希菌數(shù)量。還有眾多研究表明，在飼料中添加甘露寡糖對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的促增重效果明顯[4，7，11，13]，促進(jìn)腸道乳酸桿菌增殖并抑制大腸埃希菌定植[8]，提高前、后腸皺襞高度和小腸絨毛密度、寬度與高度[5，7]。這些研究表明，甘露寡糖的促生長(zhǎng)作用可能與其顯著促進(jìn)腸道發(fā)育，改善腸道微生態(tài)環(huán)境有關(guān)。

本試驗(yàn)在飼料中添加200、400 mg/kg甘露寡糖，顯著提高了泥鰍的特定生長(zhǎng)率和肥滿度，降低了餌料系數(shù)；顯著提高了泥鰍的腸體指數(shù)、腸長(zhǎng)指數(shù)；顯著促進(jìn)了腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖，對(duì)大腸埃希菌有極顯著的抑制作用。表明在泥鰍飼料中添加200～400 mg/kg甘露寡糖，可促進(jìn)泥鰍腸道發(fā)育，優(yōu)化腸道微生態(tài)環(huán)境，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果與前述李云蘭[2]的研究結(jié)論一致。但李富東[15]、徐磊等[16]發(fā)現(xiàn)甘露寡糖對(duì)牙鲆和異育銀鯽的增重率和餌料系數(shù)等均沒有顯著影響。

甘露寡糖影響腸道菌群的作用機(jī)理已比較清楚[18]。從結(jié)構(gòu)上看，甘露寡糖1,4糖苷鍵極少，因此不易被魚類消化吸收，直接進(jìn)入魚類后腸作為乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌群的特異性營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，促進(jìn)有益菌群增殖，而有益菌群的代謝產(chǎn)物能通過降低腸道pH或者通過在空間、營(yíng)養(yǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)性屏蔽作用來(lái)抑制有害菌在腸道上的定植和生長(zhǎng)，保證消化道菌群的平衡。對(duì)甘露寡糖促生長(zhǎng)效應(yīng)的研究結(jié)果尚不一致，還不清楚是否因魚的種類、添加甘露寡糖的時(shí)期（魚類生長(zhǎng)階段）、添加劑量和連續(xù)飼喂甘露寡糖的時(shí)間等因素所致。總之，甘露寡糖的促生長(zhǎng)機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。

3.2 甘露寡糖對(duì)泥鰍非特異性免疫功能的影響

已有研究表明，在飼料中添加適量甘露寡糖，能提高試驗(yàn)動(dòng)物脾臟指數(shù)[4]、白細(xì)胞吞噬活性[4-5，10]、血清總蛋白含量[13]、球蛋白濃度[16]、血清溶血素活力和血清殺菌百分率[4]，增強(qiáng)血清溶菌酶[2，10]、堿性磷酸酶[7，13，16]、超氧化物歧化酶[7]活性和總抗氧化力[7]，增強(qiáng)魚類的非特異性免疫功能，提高其成活率[2，11，16]。

本研究顯示，添加200或400 mg/kg甘露寡糖，顯著提高了肝胰臟和血漿SOD、CAT活性及血漿LZM含量，表明添加適量甘露寡糖（200～400 mg/kg）可增強(qiáng)泥鰍的非特異性免疫功能。與前述李云蘭等的研究結(jié)論一致。但李富東[15]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加甘露寡糖對(duì)牙鲆血清溶菌酶活力和白細(xì)胞吞噬活性均無(wú)顯著影響。推測(cè)長(zhǎng)時(shí)間飼喂甘露寡糖可能對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生了免疫抑制。