復合模板分子印跡聚合物的制備及對黃酮類化合物的吸附性能研究

楚善明，蘇立強，于亭亭，靳巖爽，韓 爽，王 穎

(1.齊齊哈爾大學化學與化學工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.佳木斯市第一中學，黑龍江佳木斯 154003)

黃酮類化合物是多種常用中藥材和天然產物(銀杏、槐米、金銀花、三七)的有效成分，主要包括槲皮素、橙皮素、木犀草素、蘆丁、山奈酚等。因該類化合物具有抗病毒及免疫調節(jié)等功能，在醫(yī)藥等領域具有廣泛的應用價值。黃酮類化合物的天然提取物[1 - 3]已用于臨床。

通過分子印跡技術[4 - 6]制備的分子印跡聚合物(MIPs)對靶向目標具有良好的選擇性，已應用于天然活性成分分離、食品工業(yè)、色譜分離、環(huán)境監(jiān)測等領域?，F有MIPs的制備主要為沉淀聚合、本體聚合、原位聚合、懸浮聚合、表面聚合等方法?；亓鞒恋砭酆戏╗7 - 9]是在傳統(tǒng)沉淀聚合法的基礎上發(fā)展的一種新型聚合技術，與傳統(tǒng)的沉淀聚合法相比，該方法反應時間短、效率更高。以黃酮類化合物分子作為模板制備印跡聚合物，并將其用于天然產物中黃酮類物質的分離提取已見諸報道。孫爽等[10]以凹凸棒為載體，蘆丁為模板制備其印跡聚合物，利用其從冬青葉中提取蘆丁。丁佳等[11]以羧基化多壁碳納米管為基質材料，芹菜素為模板制備分子印跡聚合物，使芹菜提取物中芹菜素的濃度得到有效提升。

印跡聚合物的選擇吸附性能，使其能從復雜基質中高效提取某一成分，但同時因聚合物的單一吸附性，在對某一成分提取的同時，對天然產物中其它的物質造成了浪費。近年來，復合模板[12 - 14]逐漸出現在人們的視野當中，因其不僅擴大了MIPs結合位點的識別范圍，同時又能夠對同類化合物表現出良好的親和力，解決了MIPs在同類物質吸附中的受限問題。本文以槲皮素與橙皮素為復合模板分子，采用回流沉淀法制備復合模板MIPs，對多種黃酮類化合物均表現出較大的吸附容量，為同時分離提取天然產物中黃酮類化合物提供了新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LPG3400高效液相色譜儀(美國，戴安公司)；GT10-2高速冷凍離心機(北京時代北利離心機有限公司)；TU-1901紫外/可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

槲皮素、橙皮素、山柰酚、槲皮苷、芹菜素、蘆丁、木犀草素、姜黃素、阿魏酸(分析純，西安小草植物科技有限責任公司)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(分析純，日本東京化成工業(yè)株式會社)；二乙烯基吡啶(2-VP)、甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)(分析純，天津科密歐化學試劑開發(fā)中心)；偶氮二異丁腈(AIBN)(分析純，天津光復精細化工研究所)；乙腈、甲醇、甲酸(分析純，天津科密歐化學試劑中心)。

1.2 分子印跡聚合物的制備

在100 mL圓底燒瓶中，加入模板分子槲皮素0.0755 g(0.25 mmol)，橙皮素0.0756 g(0.25 mmol)，功能單體2-VP 0.2103 g(2 mmol)，超聲溶解于80 mL甲醇中，超聲預聚合3 h。加入3.94 g(20 mmol)交聯劑EGDMA和0.0200 g 引發(fā)劑AIBN，超聲10 min，沖N2氣脫氧30 min，加入攪拌子，升溫至70 ℃，于200 r/min恒溫回流熱聚合3 h。配制乙酸體積比為10%的乙酸-甲醇溶液，將合成的聚合物索氏提取24 h，以除去聚合物上的模板分子與未反應的功能單體及交聯劑。50 ℃真空干燥24 h，即得MIPs。利用上述方法制備非印跡聚合物NIPs，但不加入模板分子。

1.3 MIPs吸附性能研究

1.3.1 靜態(tài)吸附實驗配制溶液濃度(c0)范圍在0.00～100.00 μg/mL的槲皮素與橙皮素溶液，分別向各濃度溶液中加入10 mg MIPs，靜止12 h。0.45 μm膜過濾，取1 mL的溶液，無水甲醇稀釋至3 mL，利用紫外分光光度計測出各溶液的濃度ce，根據吸附前后的模板分子濃度變化，計算出洗脫后MIPs的吸附量，依公式計算MIPs的吸附容量(Q)：Q=(c0-ce)×V/m，計算得出MIPs對不同濃度槲皮素與橙皮素的吸附容量。NIPs的吸附容量計算步驟同上。

1.3.2 動態(tài)吸附實驗取兩只100 mL錐形瓶，各放入0.0300 g的MIPs，分別加入配制好的35 mL 100 μg/mL 的槲皮素、橙皮素溶液，再加入15 mL無水甲醇，低頻超聲10 min。每間隔20 min吸取1 mL上層清液，離心5 min(800 r/min)，用0.45 μm濾膜過濾，再利用紫外分光光度計測得對應的濃度ce，計算MIPs的Q。NIPs的Q計算步驟同上。

1.4 樣品處理與固相萃取

取銀杏葉粉5 g，溶解于300 mL甲醇中，高頻超聲1 h后，回流提取3次，將3次回流提取的甲醇溶液混合后進行過濾，蒸發(fā)濃縮濾液，將濃縮后的濾液以8 000 r/min離心10 min，然后取上清液用甲醇定容至250 mL。取100 mg MIPs制備分子印跡固相萃取(MISPE)柱，依次用3 mL水和5 mL甲醇對MISPE柱進行活化后，將處理后的溶液上樣，用5 mL乙腈進行淋洗，再用10 mL體積比為9∶1的甲醇-乙酸溶液對樣品進行洗脫，將洗脫液濃縮至1 mL，用高效液相色譜法檢測。色譜條件：Hypersil ODS2色譜柱；流動相為甲醇，流速為0.5 mL/min；紫外檢測波長：350 nm。

2 結果與討論

2.1 模板分子的選擇

MIPs對目標分析物的靶向識別能力主要取決于微球內部印跡孔穴的結構及結合位點，而模板分子決定了印跡孔穴的空間結構，因此選擇合適的兩個分子作為復合模板分子，可優(yōu)化空間結構與作用位點。黃酮類模板與功能單體的結合過程中，主要依靠的是其分子中存在的活性基團羥基與醚鍵的作用等，槲皮素與橙皮素為中草藥中常見的兩種黃酮類組分，同時分子中含有多個酚羥基、醚鍵等，適合印跡。所以，本實驗選用槲皮素與橙皮素作為MIPs的復合模板分子。槲皮素和橙皮素的結構式見圖1。

圖1 槲皮素與橙皮素結構Fig.1 Structure of quercetin and hesperetin

2.2 MIPs制備時間選擇

在回流沉淀聚合反應中，反應速度快，反應時間對結果影響大，為考察制備時間對MIPs形貌的影響，對MIPs制備中不同時刻的微球形貌及粒徑范圍進行掃描電鏡分析，見圖2。由圖2可見，制備時間對印跡微球粒徑和形貌的影響非常明顯。當反應進行至1 h時，所生成的MIPs微球表面粗糙，粒徑較小，且粒度范圍較大；當反應進行至2 h時，印跡微球表面開始變光滑，粒徑范圍仍較大；當反應進行至3 h時，微球表面更加光滑，粒徑變均勻，顆粒明顯增大，粒徑約為1 μm；反應進行至4 h時，無明顯變化，所以選擇反應時間3 h。而傳統(tǒng)沉淀聚合過程一般需要24 h左右，回流沉淀聚合法在保證了微球形貌和粒徑的同時，大大縮短了聚合時間，提升了效率。

圖2 不同制備時間的MIPs微球掃描電鏡(SEM)圖Fig.2 SEM images of MIPs microspheres obtained by different preparation time

2.3 紅外光譜研究

為考察分子印跡聚合物是否制備成功，對未洗脫模板分子的印跡聚合物、MIPs和NIPs采用紅外光譜法分析，見圖3?？梢钥闯?，在未洗脫模板分子的紅外譜圖中，3 280 cm-1處為-OH伸縮振動峰，在1 612、1 513 cm-1處出現模板分子上的苯環(huán)骨架的特征吸收峰，在1 726 cm-1處出現了EGDMA的C=O伸縮振動吸收峰，表明聚合物成功制備。而在MIPs紅外譜圖中，3 430 cm-1的-OH吸收峰與未洗脫模板分子的聚合物相比，發(fā)生了明顯位移，可能是由于模板分子與功能單體之間存在的氫鍵作用力所導致的。在MIPs和NIPs的紅外譜圖中，在1 730、1 453、1 157 cm-1處均出現吸收峰，是由單體2-VP和交聯劑EGDMA引起的，且峰形基本一致，說明模板分子已洗脫完全。

2.4 靜態(tài)吸附容量

采用靜態(tài)吸附實驗對聚合物的吸附性能進行考察，繪制MIPs與NIPs對雙模板分子槲皮素與橙皮素的靜態(tài)等溫吸附曲線，見圖4。由圖4可知，MIPs對兩種模板分子槲皮素與橙皮素的吸附容量均明顯高于NIPs，原因是MIPs微球含有與槲皮素和橙皮素結構相匹配的印跡孔穴，且孔穴內規(guī)則排列著與其結構對應的結合位點；MIPs對槲皮素吸附容量達到了49.82 mg/g，對橙皮素也達到44.34 mg/g。這是由于雙模板與功能單體間的多位點協同作用，使微球內部孔穴的結構得到優(yōu)化，提高了印跡微球的分子識別能力。而NIPs微球內部不存在與其結構相匹配的印跡孔穴，主要依靠物理吸附，對兩種模板的吸附容量均較小，且無明顯差別。

圖3聚合物的紅外(IR)光譜圖Fig.3 IR spectra of polymer

圖4 靜態(tài)吸附等溫線Fig.4 Static adsorption isotherm

由圖5可知:Scatchard曲線分為兩段直線,說明聚合物主要形成兩種不同的結合位點，即高親和位點和低親和位點。

圖5 槲皮素(a)橙皮素(b)的Scatchard分析曲線Fig.5 Scatchard analysis curves of quercetin(a) and hesperetin(b)

2.5 動態(tài)吸附性能

利用動態(tài)吸附實驗對聚合物的動態(tài)吸附性能進行考察，繪制MIPs與NIPs對雙模板分子槲皮素與橙皮素的動態(tài)吸附曲線(圖略)，在1～100 min之間，MIPs的吸附速率迅速增長，在100～150 min之間，吸附速率變緩，在150 min處達到平衡。這是由于MIPs微球中存在深層與淺層兩種印跡孔穴，MIPs初始吸附主要依賴于微球表面淺穴上的識別位點來吸附模板分子，因此吸附速率較快。隨著淺穴的吸附量逐漸達到飽和，模板分子開始逐漸以傳質擴散的形式進入深穴，受到了聚合物內部的傳質阻力，吸附速率減緩。NIPs沒有與模板分子匹配的印跡孔穴，吸附速率相對平緩，吸附容量低。由表1可知，MIPs的吸附過程更符合準二級動力學模型，吸附過程主要為化學吸附，NIPs對的吸附過程更符合準一級動力學模型，屬于物理吸附。并對其進行準一級與準二級動力學模型擬合，結果見表1。

表1 MIPs及NIPs的準一級和準二級動力學模型參數

2.6 選擇性吸附性能

為探究MIPs的特異性識別能力，選擇了包括模板分子在內的7種常見黃酮類化合物，以及另外兩種天然產物中的非黃酮類藥物姜黃素、阿魏酸作為吸附底物。通過平衡吸附實驗測定MIPs對9種化合物的平衡吸附容量，計算印跡因子：α(α=QMIPs/QNIPs)，結果見表2。

如表2所示，MIPs對模板分子槲皮素與橙皮素的吸附容量最大，分別達到49.82 mg/g、44.34 mg/g，印跡因子α也達到了最高的2.871與2.896。原因是聚合物內部存在與模板分子相匹配的孔穴結構，表現出了對模板分子的特異選擇性能；同時，MIPs對其他5種黃酮類物質的吸附容量也較高，在46.65～37.54 mg/g之間，α達到2.665～2.081范圍。這是由于復合模板的引入優(yōu)化了MIPs內部孔穴的空間結構，可使MIPs識別出與模板分子結構類似的其他黃酮類化合物，表現出良好的組選擇性；MIPs對姜黃素與阿魏酸兩種非黃酮類物質的吸附容量較小，只有15.37 mg/g和18.92 mg/g。這是由于姜黃素、阿魏酸在分子結構上與模板分子具有明顯差別，導致其與MIPs內部孔穴不匹配，因此其吸附容量較小；NIPs對9種化合物的吸附容量均較低，沒有顯著差異。原因是NIPs在制備中沒有加入模板分子，微球的內部不存在與其相匹配的印跡孔穴，因此沒有選擇性。

2.7 黃酮類化合物的提取

2.7.1 MISPE-HPLC方法的建立分別以7種黃酮類化合物(蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、木犀草素、芹菜素、橙皮素)的濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，在0.1 ～ 20 mg/L的濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數R2范圍在0.9993～1之間，以3倍的信噪比計算檢測限范圍在0.06～0.44 μg/L之間。

2.7.2 實際樣品分析以MIPs為固相萃取填料制備MISPE柱，對銀杏葉中黃酮類化合物進行分離富集后，經HPLC分析，結果見圖6。由圖可知，樣品經MISPE柱分離富集后，有效去除了基質的干擾。并且，使用過的MIPSPE柱經處理后，重復使用10次，黃酮類化合物回收率仍在90%以上，說明MIPs材料比較穩(wěn)定，再生性能良好。

圖6 銀杏葉樣品色譜圖Fig.6 Chromatograms of Ginkgo biloba sample1:Rutin;2:Quercitrin;3:Quercetin;4:Luteolin;5:Apigenin;6:Kaempferol;7:Hesperitin.

2.7.3 加標回收實驗對銀杏葉樣品中的7種黃酮類化合物進行3水平加標回收實驗，結果見表3，回收率在94.85%～98.30%范圍內，相對標準偏差(RSD)≤1.8%。

表3 銀杏葉樣品中黃酮類化合物加標回收實驗

3 結論

采用回流沉淀聚合法，以槲皮素和橙皮素作為復合模板，制備了對黃酮類化合物具有組選擇性能的MIPs。掃描電鏡分析確定了反應的最佳時間為3 h。吸附實驗表明，MIPs對黃酮類化合物均具有較高的吸附容量，其范圍介于46.65～37.54 mg/g之間。以復合模板MIPs作為固相萃取吸附劑對銀杏葉中7種黃酮類物質進行分離富集，能有效去除基質雜質，達到分離提純的目的，且MIPs重現性較好。同時證明此MIPs有望在天然產物中黃酮類化合物的分離純化，以及工業(yè)上制備對黃酮類化合物具有特異吸附性能材料方面得到進一步的應用。