微生物學(xué)技術(shù)在食品專業(yè)綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用與實(shí)踐
——以“豬源大腸桿菌耐藥性調(diào)查研究”為例

蔣 晗，李佳瑤，方結(jié)紅，黃光榮，朱誠(chéng)

（中國(guó)計(jì)量大學(xué)浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310018）

0 引言

食品質(zhì)量與安全專業(yè)自2002年招生至今，已在117所大學(xué)開(kāi)設(shè)，分布在農(nóng)、工、商、師、醫(yī)、水及綜合等各類高校。而食品質(zhì)量與安全專業(yè)綜合實(shí)驗(yàn)是本科生在學(xué)習(xí)了食品學(xué)科基礎(chǔ)課程、專業(yè)基礎(chǔ)課程和專業(yè)課程，具有了一定理論基礎(chǔ)、專業(yè)技能和科學(xué)思維后，所進(jìn)行的實(shí)踐性教學(xué)環(huán)節(jié)，是培養(yǎng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力、實(shí)驗(yàn)操作能力、問(wèn)題總結(jié)能力和交流協(xié)調(diào)能力的一門側(cè)重點(diǎn)在“質(zhì)量”與“安全”上的專業(yè)綜合實(shí)驗(yàn)課程，也是食品質(zhì)量與安全專業(yè)本科生的必修課[1]。

食品質(zhì)量與安全專業(yè)綜合實(shí)驗(yàn)是一門獨(dú)立成課的專業(yè)課程，它打破了傳統(tǒng)教學(xué)中實(shí)驗(yàn)課程作為教學(xué)課程的補(bǔ)充與輔助模式，形成了“學(xué)習(xí)、實(shí)踐、創(chuàng)新相互促進(jìn)”的實(shí)踐教學(xué)理念，這在提高教學(xué)質(zhì)量、加強(qiáng)學(xué)生專業(yè)綜合能力和培養(yǎng)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)意識(shí)上起到了不可替代的作用[2-6]。

以學(xué)校食品質(zhì)量與安全專業(yè)綜合實(shí)驗(yàn)課題“豬源大腸桿菌耐藥性調(diào)查研究”為例，該課題由大四第一學(xué)期食品質(zhì)量與安全專業(yè)本科生完成，由食品微生物技術(shù)方向指導(dǎo)教師進(jìn)行指導(dǎo)。試驗(yàn)采集杭州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市新鮮豬肉樣本，利用選擇性培養(yǎng)基和特異性基因uidA分離鑒定大腸桿菌，利用K-B法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)抗生素的耐藥性，并利用PCR法進(jìn)一步分析耐藥大腸桿菌攜帶耐藥基因的情況。這是一個(gè)半開(kāi)放實(shí)驗(yàn)，豬肉樣品和大腸桿菌篩選是固定內(nèi)容，而耐藥性研究是開(kāi)放的，可由學(xué)生就自己查閱的文獻(xiàn)或感興趣的內(nèi)容進(jìn)行深入研究。以下就是其中一組學(xué)生經(jīng)指導(dǎo)教師指導(dǎo)后，形成的試驗(yàn)方法與結(jié)果分析案例。

1 試驗(yàn)方法與結(jié)果

1.1 方法

1.1.1 樣品采集與前處理

樣品采集自浙江省某地區(qū)的20家農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和20家超市，每家農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市各選5個(gè)攤位，分別購(gòu)買生鮮豬肉1份（約100 g），農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市樣品總計(jì)各100份。每份生鮮豬肉獨(dú)立放置于無(wú)菌保鮮袋中，記錄采樣地點(diǎn)和采樣時(shí)間后藏于冰盒，迅速低溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，立即在超凈工作臺(tái)用滅菌剪刀剪取25 g樣品，放入無(wú)菌袋內(nèi)，向無(wú)菌袋內(nèi)加入225 mL無(wú)菌蛋白胨水，用均質(zhì)器高速均質(zhì)2 min，充分混勻，收集上清液約10 mL裝入15 mL無(wú)菌離心管于4℃下冷藏備用。

1.1.2 大腸桿菌的分離和鑒定

大腸桿菌的分離方法參照GB 4789.38—2012食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)。大腸桿菌的分子鑒定方法驟如下：在NCBI網(wǎng)站下載大腸桿菌特異基因序列 uidA（GenBank ID：S69414），并利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物：uidAF：5’-GTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAA-3'； uidAR：5'-GGGATAGTCTGCCAGTTCAGTTCGT-3'。引物由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系（25.0μL）：上、下游引物各 1.0μL（10μmol/L），模板 DNA 2.0μL（250ng/μL），Premix Taq12.5μL，加ddH2O至25.0μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min，98℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL，于1.2% 瓊脂糖凝膠中電泳，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.1.3 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推薦的 K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，篩選對(duì)氯霉素類的氯霉素、氨基糖苷類的慶大霉素、磺胺類的復(fù)方新諾明、四環(huán)素類的四環(huán)素、喹諾酮類的環(huán)丙沙星、β-內(nèi)酰胺類的頭孢西丁等抗生素具有耐藥性的大腸桿菌。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑大小，比對(duì)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，分別判斷該菌為耐藥（R）、中介（I）或敏感（S）。

1.1.4 四環(huán)素類耐藥基因tetA的檢測(cè)

利用試劑盒法提取大腸桿菌基因組DNA，用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)tetA特異性引物：tetAF：5'-GGCACCGAATGCGTAGAT-3'；tetAR：5'-AAGCG AGCGGGTTGAGAG-3'。引物由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系 （25.0μL）：上、下游引物各 1.0μL（10 μmol/L）， 模 板 DNA 2.0 μL（250 ng/μL），Premix Taq 12.5μL，加ddH2O至 25.0μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min，98℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL，于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.2 結(jié)果與分析

1.2.1 大腸桿菌的分離和鑒定

通過(guò)伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基從100份農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)生鮮豬肉樣品中分離到大腸桿菌100株（每份樣品計(jì)分離株1株），未從超市生鮮豬肉樣品中分離到大腸桿菌。選用大腸桿菌特異性基因uidA為擴(kuò)增對(duì)象，對(duì)疑似菌株進(jìn)行PCR鑒定，標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O作陰性對(duì)照，大腸桿菌特異性條帶為424 bp。經(jīng)PCR鑒定，100株農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)生鮮豬肉源大腸桿菌疑似菌株均出現(xiàn)特異性條帶，陽(yáng)性檢出率達(dá)到100%。

大腸桿菌分離鑒定見(jiàn)圖1。

圖1 大腸桿菌分離鑒定

1.2.2 大腸桿菌耐藥情況分析

豬源大腸桿菌分離株藥敏分析見(jiàn)表1。

由表1可知，①農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)樣品中大腸桿菌對(duì)于慶大霉素、氯霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、頭孢西丁、環(huán)丙沙星6種抗生素耐藥率分別為5%，52%，14%，100%，5%，19%；②分析結(jié)果表明，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)來(lái)源的大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率顯著高于對(duì)頭孢西丁、環(huán)丙沙星、氯霉素、復(fù)方新諾明和慶大霉素等5種抗生素的耐藥率（p＜0.05）；③多重耐藥率達(dá)到59%，表明豬源大腸桿菌的多重耐藥性已經(jīng)成為普遍現(xiàn)象。

表1 豬源大腸桿菌分離株藥敏分析

大腸桿菌K-B藥敏試驗(yàn)示意圖見(jiàn)圖2。

圖2 大腸桿菌K-B藥敏試驗(yàn)示意圖

1.2.3 四環(huán)素類耐藥基因型tetA檢測(cè)結(jié)果

利用PCR方法對(duì)大腸桿菌四環(huán)素類耐藥基因tetA的攜帶情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示大腸桿菌中tetA基因的檢出率達(dá)到65.00%（65/100），表明對(duì)四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生耐藥性的大腸桿菌中大多富含tetA基因。

四環(huán)素類耐藥基因tetA凝膠電泳圖見(jiàn)圖3。

圖3 四環(huán)素類耐藥基因tetA凝膠電泳圖

2 試驗(yàn)教學(xué)效果分析

通過(guò)綜合實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，學(xué)生能夠掌握微生物檢驗(yàn)的國(guó)標(biāo)方法，微生物分子生物學(xué)基本設(shè)計(jì)與操作、美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦的K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)等一系列重要的微生物學(xué)技術(shù)。對(duì)于大部分基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)采用計(jì)劃安排的方式，在規(guī)定時(shí)間由全班學(xué)生統(tǒng)一完成，如此次實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌分離鑒定工作。對(duì)于少部分綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)采用課堂教學(xué)和小組預(yù)約結(jié)合的方式，如豬肉采樣和前處理工作，由指導(dǎo)教師課堂教學(xué)采樣及前處理方式，再由每5～6位學(xué)生具體負(fù)責(zé)一個(gè)區(qū)域的采樣，并立即送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行前處理工作，指導(dǎo)教師或研究生現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)。對(duì)于研究創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)采用學(xué)生個(gè)人預(yù)約的方式，如此次實(shí)驗(yàn)的耐藥數(shù)據(jù)分析處理工作，可由每位學(xué)生根據(jù)自己感興趣的角度對(duì)大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并撰寫(xiě)論文，期間可預(yù)約指導(dǎo)教師進(jìn)行探討。通過(guò)多種渠道投入，逐步形成理論教學(xué)與實(shí)踐教學(xué)相互協(xié)調(diào)的實(shí)踐新體系。

加強(qiáng)師生有效互動(dòng)，在指導(dǎo)教師的幫助下，食品質(zhì)量與安全專業(yè)本科生有更多機(jī)會(huì)鍛煉科學(xué)思維，提升科研能力。在綜合實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)過(guò)程中，以學(xué)生為主體，指導(dǎo)教師采用討論式教學(xué)和啟發(fā)式教學(xué)，起到引領(lǐng)方向和答疑解惑的作用，既有大課堂的理論教學(xué)，又有分組及點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的討論，以多種形式啟發(fā)引導(dǎo)學(xué)生自主學(xué)習(xí)，獨(dú)立分析、思考、和解決問(wèn)題。

最后，在雄厚的科研實(shí)力支撐下，將科研中的先進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法與內(nèi)容帶進(jìn)實(shí)踐教學(xué)中，以實(shí)驗(yàn)內(nèi)容改革引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)技術(shù)開(kāi)發(fā)，新型的實(shí)驗(yàn)技術(shù)成果又反過(guò)來(lái)推動(dòng)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不斷完善。同時(shí)，安排高層次理論課教師擔(dān)當(dāng)實(shí)踐教學(xué)、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目開(kāi)發(fā)和實(shí)驗(yàn)室管理，既加強(qiáng)了理論教學(xué)、科學(xué)研究與實(shí)踐教學(xué)的結(jié)合，提高了實(shí)踐教學(xué)水平，又帶動(dòng)和幫助實(shí)驗(yàn)教師提高教學(xué)與科研水平，提高實(shí)踐教學(xué)質(zhì)量。