巨噬細胞移動抑制因子在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用及機制

吳躍斌，黃漫枝，蔡文鋒，汪 彬，石剛剛

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041）

心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）損傷，是指心肌組織經(jīng)過一段時間的缺血后，血流重新恢復(fù)正常，造成組織損傷的程度較缺血時加重、器官功能持續(xù)惡化的現(xiàn)象。心肌I/R損傷的主要機制包括ROS的產(chǎn)生[1]、細胞內(nèi)鈣超載[2]、pH值的改變[3]、炎癥反應(yīng)[4]、能量供應(yīng)不足[5]等。巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一個多向性趨化促炎因子，在機體中分布廣泛，參與包括動脈粥樣硬化、敗血病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腦損傷、肺損傷和肝臟的缺血等多種疾病[6]。多年來對MIF在心肌I/R中的作用報道不一致，有認為MIF主要是致炎因子，通過炎癥介導(dǎo)損傷[7-8]。有些認為MIF主要通過調(diào)節(jié)AMPK通路激活能量代謝起到保護作用[9]。我們在前期實驗中發(fā)現(xiàn)心肌細胞在缺氧再復(fù)氧（hypoxia reoxygenation，H/R）過程中，MIF的表達呈現(xiàn)“先高后低”的現(xiàn)象。在細胞H/R早期，MIF抗體能使炎癥因子產(chǎn)生減少，損傷減輕，重組MIF使炎癥因子增多，損傷加重；在細胞H/R晚期，MIF抗體能抑制AMPK磷酸化，損傷加重，重組MIF能激活A(yù)MPK磷酸化，損傷減輕。所以MIF早期表達升高主要起到介導(dǎo)炎癥的作用，MIF晚期表達過低導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，說明MIF表達過高或過低都可以加重心肌細胞H/R損傷，表明MIF在H/R的不同時間段，發(fā)揮不同的作用，在心肌細胞H/R過程中維持MIF表達相對恒定是非常重要的。為此，我們利用正常小鼠和敲除MIF基因小鼠建立心肌I/R模型，觀察MIF異常表達在心肌I/R損傷中扮演的角色，并驗證與離體心肌細胞H/R損傷的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 野生型C57BL/6Cnc小鼠，SPF級，8～12周齡，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。MIF基因敲除C57BL/6Cnc小鼠由上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司構(gòu)建，本課題組自己繁殖鑒定。

1.1.2 主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉購自德國Merck公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase，CK-MB）ELISA試劑盒購自四川新健康成生物股份有限公司；MIF抗體、CD11b抗體購自英國Abcam公司；MIF抑制劑ISO-1、AICAR購自美國MCE公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司）；Vevo LAZR小動物多模成像系統(tǒng)（加拿大Fujifilm VisualSonics公司）；TBA-40FR全自動生化分析儀（日本Toshiba公司）；Spectra Max M2多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌I/R模型的建立及給藥 小鼠禁食12 h后稱重，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg），待小鼠麻醉至四肢無劇烈反應(yīng)時，固定于手術(shù)臺，用脫毛膏脫去胸部的毛。將氣管插入小鼠呼吸道，氣管連接呼吸機，呼吸機參數(shù)：呼吸頻率115，呼吸比1.3∶1.0，潮氣量2.0。于左側(cè)胸口開胸，用鑷子鈍性分離胸大肌和胸小肌，在第3和第4肋骨之間分離肋間肌，撕開心包膜，暴露出心臟；用8-0尼龍線結(jié)扎左前降支冠狀動脈，位置在左心耳下2～3 mm處，此時心電圖可見ST段明顯抬高，心臟的心尖能看到發(fā)白；缺血時間到后，剪開結(jié)扎線，心電圖ST段回落，心臟恢復(fù)供血，心尖重新恢復(fù)紅色，表明心肌I/R模型建立成功。逐層縫合肋間、胸小肌、胸大肌和皮膚。給藥：二甲基亞砜（DMSO）、ISO-1（30 mg/kg）、AICAR（700 mg/kg）于缺血45 min后再灌注3 h（I45 min/R3 h）時腹腔注射給藥。

1.2.2 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法隨機分組。（1）野生型C57BL/6Cnc小鼠隨機分成5組：假手術(shù)組（sham組）、缺血15、30、45、60 min組（I15 min組、I30 min組、I45 min組、I60 min組），每組各6只。（2）野生型C57BL/6Cnc小鼠隨機分成6組：sham組、缺血45 min再灌注0.5、2、3、4、5 h組（I45 min/R0.5 h組、I45 min/R2 h組、I45 min/R3 h組、I45 min/R4 h組、I45 min/R5 h組），每組各6只。（3）野生型C57BL/6Cnc小鼠隨機分成5組：sham組、I45 min/R4 h組、DMSO組、ISO-1組、AICAR組，每組各6只。（4）野生型C57BL/6Cnc和MIF基因敲除型C57BL/6Cnc小鼠隨機各分為2組：sham組、I45 min/R0.5 h組。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測MIF蛋白的表達水平 提取小鼠心肌組織蛋白，按100 mg/mL加入裂解液，用乳化分散儀分散4次，每次10 s。于冰上放置30 min，每10 min振蕩1次。12 000 r/min，4℃，離心15 min，取上清，按4∶1加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min變性。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳（50 V）至分離膠后，更換100 V電壓繼續(xù)電泳約1 h，15 V半干轉(zhuǎn)75 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10 min/次。二抗室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。滴加發(fā)光液，于暗室用X光膠片曝光。

1.2.4 Vevo LAZR小動物多模成像系統(tǒng)檢測心功能 將小鼠胸部毛用脫毛膏脫干凈，采用2.5%（體積分數(shù)）異氟烷氣體誘導(dǎo)麻醉，1.0%（體積分數(shù)）異氟烷氣體維持麻醉，將小鼠固定在小動物多模成像恒溫操作臺上操作，用MS-400超聲探頭在胸骨旁短軸切面分別采集M-Mode和B-Mode圖像。由圖像數(shù)據(jù)分析可得左心室射血分數(shù)和短軸縮短率。

1.2.5 免疫熒光法觀察組織切片CD11b的表達 在心肌組織乳頭肌位置橫切制作冰凍切片，厚度4 μm，切片后4℃于4%多聚甲醛中固定15 min，用PBS洗滌5 min，重復(fù)3次，用免疫熒光封閉液室溫封閉1 h，滴加50 μL CD11b抗體（用1∶50封閉液稀釋），于4℃孵育過夜。復(fù)溫30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加50 μL Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG（用1∶1000二抗稀釋液稀釋）。以下步驟都需避光，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI染核5 min，PBS洗滌5 min，滴加抗熒光猝滅封片液，蓋玻片封片，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.6 二氫乙錠（dihydroethidium，DHE）染色法觀察組織切片ROS的表達 在心肌組織乳頭肌位置橫切制作冰凍切片，厚度為4 μm，將DHE原液用PBS稀釋3 000倍，每個玻片滴加50 μL稀釋后的DHE，37℃孵育30 min。PBS沖洗終止染色，滴加抗熒光猝滅封片液，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.7 ELISA試劑盒檢測小鼠血清LDH、CK、CK-MB的活性 檢測CK時小鼠血清用生理鹽水稀釋64倍；檢測LDH、CK-MB時，小鼠血清用生理鹽水稀釋16倍。每個樣吸取100 μL于檢測管，用TBA-40FR全自動生化分析儀測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，采用單因素方差分析進行組間比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠心肌I/R時MIF蛋白表達的時效變化

與sham組相比，I15、I30、I45、I60 min組MIF蛋白的表達都上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且在I45 min時表達最高，圖1A。因此選擇I45 min為缺血時間進行心肌I/R造模。與sham組相比I45 min/R0.5 h、I45 min/R 2 h、I45 min/R 3 h MIF的蛋白表達都有所上調(diào)，在I45 min/R 2 h時達到最高，I45 min/R 3h時出現(xiàn)下調(diào)的趨勢。與sham組相比I 45min/R 4h、I45 min/R5 h MIF的表達都下調(diào)，并且I45 min/4 h最低，圖1B。所以選擇I45 min/R0.5 h作為造模的短時間點，I45 min/4 h作為造模的長時間點。

圖1 小鼠心肌MIF蛋白表達的時效變化

2.2 MIF在小鼠心肌短時間I/R損傷中的作用

2.2.1MIF基因敲除能改善小鼠短時間I/R的心功能損傷 與sham組比，野生型小鼠I45 min/R0.5 h后，射血分數(shù)、短軸縮短率均明顯降低（P＜0.05）。與野生型小鼠比較，MIF基因敲除小鼠在I45 min/R0.5 h后，心功能得到明顯的改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖2。

圖2 MIF基因敲除改善小鼠短時間I/R的心功能損傷

2.2.2MIF基因敲除能減少小鼠短時間I/R的炎癥細胞聚集 與sham組比，野生型小鼠I45 min/R0.5 h后，使用CD11b標(biāo)記的炎癥細胞明顯增多，而MIF基因敲除小鼠在I45 min/R0.5 h后，炎癥細胞明顯減少，圖3。表明MIF基因敲除能減少炎癥細胞，改善心肌短時間I/R帶來的炎癥損傷。

2.3 MIF在小鼠心肌長時間I/R損傷中的作用

2.3.1 MIF抑制劑增加長時間I/R血清酶的漏出，AMPK激動劑減少酶的漏出 與sham組比較，小鼠在長時間I/R后，LDH、CK-MB、CK的漏出明顯增多（P＜0.05）。在I45 min/R3 h時注射ISO-1能增加心肌酶的漏出，而注射AICAR卻能減少心肌酶的漏出，圖4。

2.3.2 MIF抑制劑加重心肌長時間I/R心功能損傷，AMPK激動劑改善心功能損傷 與sham組比較，小鼠在心肌長時間I/R后，心功能指標(biāo)射血分數(shù)、短軸縮短率明顯減低（P＜0.05）。在I45 min/R3 h時注射ISO-1能加大射血分數(shù)、短軸縮短率的降低程度，而注射AICAR能改善心肌長時間I/R帶來的心功能損傷（圖5）。

圖3 MIF基因敲除減少小鼠短時間I/R時炎癥細胞聚集（×400）

圖4 ISO-1和AICAR對小鼠心肌長時間I/R損傷時血清酶漏出的影響

圖5 ISO-1和AICAR對小鼠長時間I/R損傷時心功能的影響

2.3.3 MIF抑制劑增加心肌長時間I/R時ROS的產(chǎn)生，AMPK激動劑減少ROS的產(chǎn)生 與sham組比較，小鼠在長時間I/R后，ROS的產(chǎn)生明顯增多（P＜0.05）。在I45 min/R3 h時注射ISO-1能增加ROS的產(chǎn)生，而注射AICAR能減少長時間心肌I/R導(dǎo)致的ROS的產(chǎn)生增加，圖6。

圖6 ISO-1和AICAR對小鼠長時間I/R損傷時ROS的影響（×200）

3 討論

MIF作為一種致炎因子，在心肌I/R中發(fā)揮著重要的角色[10-11]，而近年來報道突出了MIF在心肌I/R過程中的抗自由基[12]、抗凋亡[13]、保護自噬功能[14]和促進能量產(chǎn)生[15]等作用。我們前期在細胞水平缺氧再復(fù)氧實驗中，即在原代心肌細胞、微血管內(nèi)皮細胞以及H9c2心肌細胞株進行H/R造模，發(fā)現(xiàn)在H/R過程中，MIF的表達呈現(xiàn)一個“先高后低”的現(xiàn)象。在心肌I/R中，MIF主要與炎癥反應(yīng)和能量代謝密切相關(guān)，早期MIF的高表達不會影響能量代謝不足，顯然是參與激活炎癥而加重了I/R損傷。后期低表達，顯然與炎癥反應(yīng)關(guān)系不大，主要是影響能量代謝，進一步加重損傷。因此，維持MIF平衡對于改善心肌I/R損傷非常重要。

MIF在后期表達水平低于缺血前，在此基礎(chǔ)上，注射MIF抑制劑，損傷進一步加重。眾所周知，MIF是調(diào)控AMPK的關(guān)鍵因子，在能量攝取和代謝方面起著重要作用，實驗中也發(fā)現(xiàn)AMPK激動劑能明顯改善損傷。在以后的工作中我們將采用MIF激動劑或重組MIF直接觀察AMPK的變化，進一步闡明MIF在心肌I/R過程中通過調(diào)控AMPK維持能量代謝的重要性。

綜上所述，本研究從整體水平上說明了MIF在心肌I/R中所扮演的角色，為MIF成為干預(yù)心肌I/R損傷潛在靶點提供了有力的理論支持。