免疫組織化學(xué)及PCR技術(shù)對淋巴結(jié)結(jié)核病的診斷價值

陳輝娥，姜訓(xùn)忠，聶 鴻，李延?xùn)|，周 芳

(深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518104)

淋巴結(jié)結(jié)核是指機體內(nèi)由于感染結(jié)核分枝桿菌而導(dǎo)致的淋巴結(jié)炎，通常包括深部與體表淋巴結(jié)結(jié)核，其中淺表淋巴結(jié)結(jié)核以頸部最為常見，深部淋巴結(jié)結(jié)核則在胸腔、盆腔、腹腔等處較為常見，臨床癥狀主要有淋巴結(jié)腫大、壓痛或疼痛等[1-2]。既往臨床常應(yīng)用抗酸染色進(jìn)行檢測，但其敏感度較低，加之抗酸桿菌尋找較困難，故而診斷準(zhǔn)確率易受限[3]。本研究旨在分析免疫組織化學(xué)(IHC)及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)對淋巴結(jié)結(jié)核病的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2017年3月至2019年6月深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院收治的62例淋巴結(jié)結(jié)核患者的石蠟包埋組織標(biāo)本(結(jié)核組)，均符合《中國結(jié)核病病理學(xué)診斷專家共識》[4]中診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)病理學(xué)等確診。其中男26例，女36例；年齡18～67歲，平均年齡(45.28±5.63)歲；發(fā)病部位為腋窩5例、頸部51例、縱膈6例。選取本院同期收治的36例非淋巴結(jié)結(jié)核患者的石蠟包埋組織標(biāo)本作為非結(jié)核組，均經(jīng)病理診斷確診為其他淋巴結(jié)疾病。其中男14例，女22例；年齡20～68歲，平均年齡(45.92±5.71)歲；壞死性淋巴結(jié)炎8例，淋巴結(jié)結(jié)節(jié)病13例，其他15例。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有患者均未接受相關(guān)治療且臨床資料完整。

1.2 檢測方法

1.2.1 標(biāo)本處理

組織標(biāo)本均應(yīng)用4%的中性甲醛予以固定，并行常規(guī)的石蠟包埋、標(biāo)本切片及蘇木精-伊紅染色，于顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)形態(tài)的觀察。

1.2.2 儀器、試劑

即用型快速免疫組織化學(xué)(MaxVision)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司提供)，以本院相關(guān)科室自制的多克隆抗體：Ag85B-pAb1作為IHC一抗；抗酸染色試劑盒(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司提供)；DNA提取試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司提供)；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(瑞士羅氏公司，型號：Cobas Z480)。

1.2.3 檢測操作

1)抗酸染色：石蠟切片的厚度約4 μm，行常規(guī)的二甲苯予以脫蠟，采用由高濃度至低濃度的梯度乙醇予以脫水，后入水；應(yīng)用石碳酸復(fù)紅行1 h常溫染色，經(jīng)水洗后用鹽酸酒精予以數(shù)秒分化至紅色消失，此后再行水洗；用亞甲藍(lán)進(jìn)行20 s染色后水洗；行梯度乙醇脫水處理、并用二甲苯將其透明后，取中性膠予以封片，于油鏡(1000倍)下觀察。診斷標(biāo)準(zhǔn)：抗酸桿菌顯示紅色桿狀、串珠狀、稍彎曲，其他細(xì)菌或細(xì)胞均呈藍(lán)色。

2)IHC染色：均行MaxVision一步法染色。對自制的多克隆抗體：Ag85B-pAb1，按1:2000的比例進(jìn)行稀釋。染色前所有切片均行高壓抗原熱修復(fù)，并嚴(yán)格遵照試劑盒說明書操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，應(yīng)用蘇木素進(jìn)行對比染色。將已知的Ag85B陽性片作為染色時的陽性對照，陰性對照應(yīng)用磷酸鹽緩沖液替代一抗。陽性染色的信號特征：著色為小雪片狀、小斑片狀或點簇狀；著色位置中心顏色深，周圍的顏色漸淺；常于壞死組織或其周圍進(jìn)行表達(dá)；著色多為點狀性分布。

3)DNA提取、熒光定量PCR檢測：石蠟切片的厚度在4 μm，可視情況切成5～10片，放于1.5 mL的離心管內(nèi)，兩種檢測的操作均需嚴(yán)格按相關(guān)說明書步驟進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件設(shè)為37 ℃ 2 min、94 ℃ 2 min、(93 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s)×40次循環(huán)，反應(yīng)體系是40 μL，于60 ℃行熒光測定，用Taqman熒光探針標(biāo)記FAM。在檢測時均需有陽性和陰性對照。檢測標(biāo)準(zhǔn)：陰性為循環(huán)數(shù)(Ct值)=40或未見擴(kuò)增曲線；陽性為Ct值≥38；重新測定：Ct值38～40；若重新測定后其Ct值仍在上述重新測定范圍，且呈S形擴(kuò)增曲線則判為陽性，若呈現(xiàn)非典型曲線則判為陰性。

1.3 觀察指標(biāo)

以手術(shù)病理結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析抗酸染色、熒光定量PCR及IHC染色在淋巴結(jié)結(jié)核病檢測中的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料用百分比表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組抗酸染色、熒光定量PCR及IHC染色的檢測結(jié)果

非結(jié)核組抗酸染色、熒光定量PCR以及IHC染色結(jié)果均為陰性，結(jié)核組熒光定量PCR檢測的陽性率高于抗酸、IHC染色(64.5%比30.6%、54.8%，P<0.05)，見表1。

表1 2組抗酸染色、熒光定量PCR及IHC染色的檢測結(jié)果 例

2.2 抗酸染色、熒光定量PCR及IHC染色的診斷效能

與抗酸染色及IHC染色相比，熒光定量PCR檢測的敏感度、準(zhǔn)確度均更高(P<0.05)，見表2。

表2 62例患者抗酸染色、熒光定量PCR及IHC染色的診斷效能 %(n/n)

3 討論

由于淋巴結(jié)結(jié)核為肺外結(jié)核，臨床僅可通過針吸穿刺或行手術(shù)切除獲取病灶組織進(jìn)行病理學(xué)診斷，少數(shù)醫(yī)院可行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)，但細(xì)菌培養(yǎng)的陽性檢出率較低，加之診斷周期較長，故而較難滿足臨床的需求[5]。因此，肺外結(jié)核的主要診斷方式為病理學(xué)診斷，且目前主要通過抗酸染色法與形態(tài)學(xué)檢查進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確度不高，故而積極尋找有效的檢測方法是當(dāng)前主要任務(wù)[6]。

本研究結(jié)果顯示，與抗酸染色及IHC染色相比，熒光定量PCR檢測的敏感度、準(zhǔn)確度均較高，且IHC染色的敏感度與準(zhǔn)確度與熒光定量PCR較為接近，提示IHC染色及PCR技術(shù)對淋巴結(jié)結(jié)核病的診斷均具有較高的價值。分析原因主要為：IHC染色的主要檢測物質(zhì)是機體蛋白質(zhì)，Ag85B是MTB中較為重要的一類分泌蛋白，能夠引起機體免疫反應(yīng)，且表達(dá)量較高，可達(dá)總分泌蛋白的5%左右，且可分布在細(xì)胞周圍空間內(nèi)，本研究對自制的MTB分泌蛋白Ag85B抗體進(jìn)行了IHC檢測，故而能夠顯著提升其顯色信號的范圍和強度，有助于提高疾病診斷的靈敏性；同時由于其在高倍鏡下即能取得較為明確的信號，其審片的診斷速度較高，加之其操作較為簡單，結(jié)果等待時間較短，故而易被掌握，但由于Ag85B在其他分枝桿菌中均有同源蛋白分布，故易出現(xiàn)誤診情況[7]。而熒光定量PCR主要檢測的核酸，其能夠在DNA擴(kuò)增反應(yīng)完成后自動迅速對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，故而重復(fù)性及客觀性較好，準(zhǔn)確度較為可靠，且擴(kuò)增時間較短僅為1.5 h，但其對實驗室及專業(yè)技術(shù)的要求較高[8]。本研究結(jié)果表明，熒光定量PCR、IHC染色、抗酸染色的敏感度分別為64.52%、54.84%、30.65%,準(zhǔn)確度分別為77.55%、71.43%、56.12%，熒光定量PCR和IHC染色的敏感度、準(zhǔn)確度均高于抗酸染色(P<0.05)?？傊?，相較于抗酸染色，熒光定量PCR與IHC染色檢測均具有較高的敏感度及準(zhǔn)確度，對淋巴結(jié)結(jié)核病有較高的診斷價值。