尋常型銀屑病患者體內(nèi)半乳糖凝集素家族蛋白表達(dá)研究

程慶， 王曉華， 楊斌

(南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心， 廣東 廣州 510091)

銀屑病是一種慢性炎癥性、增生性皮膚病，臨床表現(xiàn)以紅斑、鱗屑為主，具有頑固性和復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)，引起皮損部位疼痛、瘙癢、出血等不適，干擾患者的日常生活[1]。銀屑病在世界范圍內(nèi)自然人群中發(fā)病率占1%～3%，2008年流行病學(xué)調(diào)查顯示我國(guó)患病率為0.47%，且發(fā)病率、患病率均有逐年升高的趨勢(shì)[2]。銀屑病發(fā)病機(jī)理比較復(fù)雜，目前認(rèn)為其是由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病，多種細(xì)胞(包括樹突狀細(xì)胞、Th17、Tc17、中性粒細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞等)參與銀屑病發(fā)病過程[3]，但詳細(xì)機(jī)理仍待進(jìn)一步闡明。雖然銀屑病的治療方案很多，但因其易復(fù)發(fā)、不能治愈，目前仍缺乏對(duì)所有銀屑病患者治療均有效的藥物[4]，因此尋找新的治療靶標(biāo)意義重大。

半乳糖凝集素(galectin，Gal)家族是一類與含β-半乳糖苷殘基的多聚糖具有很高親和力的內(nèi)源性凝集素家族。迄今為止，已有15個(gè)半乳糖凝集素家族成員被發(fā)現(xiàn)，它們均具有高度保守的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域，可表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜或細(xì)胞外基質(zhì)[5]，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、細(xì)胞間的粘附、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)[6-7]。目前Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9的研究較多，其中Gal-1可抑制免疫反應(yīng)[7-8]、調(diào)節(jié)創(chuàng)面修復(fù)[9]，Gal-3參與調(diào)節(jié)皮膚腫瘤[10]、創(chuàng)面愈合[11]，Gal-7在皮膚中主要表達(dá)于復(fù)層扁平上皮[5, 12]，調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡、增殖和遷移，影響皮膚屏障功能[13]，Gal-9大量表達(dá)于正常免疫系統(tǒng)，具有免疫調(diào)節(jié)作用[14]。

現(xiàn)今國(guó)內(nèi)關(guān)于Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9在銀屑病中的研究報(bào)道較少，故本文通過對(duì)4種半乳糖凝集素家族成員在尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris, PV)患者體內(nèi)表達(dá)的研究，為探究銀屑病發(fā)病機(jī)理、開發(fā)新的治療藥物提供思路。

1 資料與方法

1.1 病例資料

納入2017年1月-2017年9月來我院皮膚科就診，明確診斷為PV的30例病例，均符合《中國(guó)銀屑病臨床診療指南(2018簡(jiǎn)版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[15]。排除標(biāo)準(zhǔn)：近1年內(nèi)接受過系統(tǒng)性生物制劑治療；近1個(gè)月內(nèi)接受過紫外線光療、光化學(xué)治療或系統(tǒng)性銀屑病治療；近2周內(nèi)接受過局部銀屑病治療；妊娠期、哺乳期婦女。30例PV患者中男18例，女12例；年齡23～74歲，平均(49.63±15.57)歲； 銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)評(píng)分5.70～34.30分，平均(16.02±6.96)分；病程0.33～30年，平均(11.91±8.86)年。納入同期來自體檢中心的30例健康對(duì)照。其中男14例，女16例；年齡26～73歲，平均(45.20±14.40)歲。兩組年齡(t=1.14，P=0.257)和性別(2=1.07，P=0.301)相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究獲得受試者的知情同意并經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 主要試劑和儀器

Gal-1 ELISA試劑盒、Gal-7 ELISA試劑盒(RayBio)，Gal-3 ELISA試劑盒(聯(lián)科生物)，Gal-9 ELISA試劑盒(Elabscience)，兔抗人Gal-1、Gal-3、Gal-7一抗(Abcam)，兔抗人Gal-9一抗(ImmunoWay)，抗原修復(fù)液(康為世紀(jì))，抗體稀釋液(廣州深達(dá)生物制品技術(shù)有限公司)，Poly-HRP羊抗鼠/兔二抗試劑(洛孚生物科技)，DAB染色液(廣州深達(dá)生物制品技術(shù)有限公司)。顯微鏡(日本Olympus)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集 于清晨采集PV患者和健康對(duì)照的空腹靜脈血，置于非抗凝采血管中室溫靜置30 min后，3 000 rpm離心15 min分離血清，-20 ℃保存。采集其中15例PV患者的皮損組織和10例健康對(duì)照重瞼術(shù)、色素痣切除術(shù)中正常皮膚組織，經(jīng)常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋后制成蠟塊，-20 ℃保存。

1.3.2 ELISA檢測(cè)血清中Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9水平 分別按照Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9 ELISA試劑盒說明書操作，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值，由標(biāo)準(zhǔn)品擬合曲線方程計(jì)算待測(cè)血清樣本中Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9的濃度。根據(jù)試劑盒說明書，血清中Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9的檢測(cè)下限分別為4.1 ng/mL、2.46 pg/mL、20 pg/mL、4.69 pg/mL，批內(nèi)與批間變異系數(shù)均小于10%、12%。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)皮膚組織中Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9的表達(dá)及細(xì)胞定位 將皮膚標(biāo)本石蠟塊切片至3 μm厚，置70 ℃的烘箱中2 h；依次置于組織脫蠟液、95%酒精中脫蠟，流水沖洗后進(jìn)行抗原修復(fù)；3%H2O2進(jìn)行阻斷后分別滴加Gal-1(1∶800)、Gal-3(1∶8 000)、Gal-7(1∶8 000)、Gal-9(1∶300)一抗；放置在孵育盒內(nèi)4 ℃冰箱中過夜孵育約12 h；PBS沖洗后滴加Poly-HRP羊抗鼠/兔二抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、封片。光學(xué)顯微鏡下分別取3個(gè)視野，200倍放大下拍照。采用Image-Pro Plus 6.0對(duì)免疫組化片進(jìn)行平均光密度(mean optical density,MOD)值分析。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS軟件處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，PV患者與正常對(duì)照組血清與皮膚組織中Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9的表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)血清中Gal-1與PASI評(píng)分的相關(guān)性。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清中Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9水平比較

ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，與正常對(duì)照相比，PV患者血清中Gal-1明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Gal-3、Gal-7、Gal-9無明顯變化(P值均>0.05)，詳見表1。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PV患者血清中Gal-1水平與PASI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.37，P=0.049)，詳見圖1。

表1 血清中半乳糖凝集素的濃度測(cè)定Tab.1 Determination of the concentration of galectins

圖1 PV患者血清中Gal-1水平與PASI評(píng)分正相關(guān)Fig.1 Serum level of Gal-1 in PV patients was positively correlated with PASI score.

2.2 皮膚組織中Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9的表達(dá)及細(xì)胞定位

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，正常皮膚與PV患者皮損組織中，Gal-1均主要表達(dá)于真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞，表皮中僅有少量細(xì)胞表達(dá)，可定位在細(xì)胞核和細(xì)胞漿，但PV皮損真皮乳頭層大量細(xì)胞高表達(dá)Gal-1。正常皮膚的表、真皮與PV皮損真皮中均有較多細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)Gal-3，但PV皮損表皮的大量顆粒層角質(zhì)細(xì)胞弱表達(dá)Gal-3，角質(zhì)層角化不全，基底層的角質(zhì)形成細(xì)胞中Gal-3表達(dá)較低。正常皮膚和PV皮損中，Gal-7均主要表達(dá)于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，可定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，但PV皮損中角質(zhì)層角化不全的角質(zhì)形成細(xì)胞Gal-7陰性。Gal-9主要表達(dá)于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，可定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，正常皮膚中表皮大量細(xì)胞為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而PV皮損表皮中大量細(xì)胞為弱陽(yáng)性表達(dá)，Munro微膿腫處中性粒細(xì)胞可見較強(qiáng)表達(dá)。詳見圖2。

圖2 免疫組化檢測(cè)PV皮損與正常皮膚組織中Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9(200×)Fig.2 Immunohistochemical staining of Gal-1, Gal-3, Gal-7, Gal-9 in psoriatic lesions and normal skin (200×).

2.3 MOD分析

采用MOD半定量分析免疫組化片中Gal的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PV皮損中真皮處Gal-1表達(dá)(0.030±0.043)明顯高于正常皮膚(0.011±0.002)，t=3.34，P=0.003；皮損表皮處Gal-3表達(dá)(0.016±0.001)明顯低于正常皮膚(0.060±0.018)，t=-2.85，P=0.009；皮損表皮處Gal-7表達(dá)(0.090±0.011)明顯高于正常皮膚(0.049±0.009)，t=2.58，P=0.017；皮損表皮處Gal-9表達(dá)(0.011±0.002)明顯低于正常皮膚(0.049±0.007)，t=-6.16，P<0.001。詳見圖3。

圖3 PV皮損與正常皮膚組織中Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9的MOD半定量分析Fig.3 The MOD of Gal-1, Gal-3, Gal-7, Gal-9 in psoriatic lesions and normal skin.

3 討論

PV的病理特征主要為角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和血管增生[1]。早期報(bào)道發(fā)現(xiàn)，Gal-1可通過與 T 細(xì)胞表面分子 CD45 結(jié)合，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)，發(fā)揮免疫抑制作用[16]。Th1、Th17異?；罨閷?dǎo)PV的發(fā)生發(fā)展，已有研究表明，Gal-1在PV皮損的表皮朗格漢斯細(xì)胞及真皮樹突狀細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，可能加重PV皮損處Th1/Th17炎癥反應(yīng)[8]，但不同細(xì)胞表達(dá)的Gal-1可發(fā)揮不同的功能，例如：敲低Gal-1的表達(dá)可明顯降低視網(wǎng)膜新生血管形成[17]，皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中的惡性T細(xì)胞分泌Gal-1可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、抑制分化[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，PV皮損處真皮中Gal-1表達(dá)上調(diào)，且主要定位于真皮乳頭層；PV患者血清中Gal-1水平亦明顯高于正常對(duì)照，且與PASI評(píng)分呈明顯正相關(guān)，推測(cè)Gal-1可能促進(jìn)真皮乳頭層血管增生，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、抑制分化，加重PV病情。

Gal-3在皮膚中分布廣泛，可表達(dá)于皮膚樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 T 細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、肥大細(xì)胞、毛囊、皮脂腺和汗腺，黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[12]，可參與腫瘤免疫抑制[19]、創(chuàng)面愈合[20]及系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過程[21]。PV中Gal-3研究較少，Kotwica等[22]比較102例PV患者與65例健康對(duì)照血清中Gal-3的水平，發(fā)現(xiàn)PV患者血清中Gal-3濃度明顯高于健康對(duì)照，與PV并發(fā)左心室收縮功能下降有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PV患者血清中Gal-3的平均水平稍高于正常對(duì)照，但無明顯差異，可能與樣本量有關(guān)。Shi等[23]發(fā)現(xiàn)，PV皮損表皮中Gal-3表達(dá)明顯低于正常皮膚與非皮損皮膚，且具有特異性，在其他PV樣皮炎，如神經(jīng)性皮炎、慢性濕疹等皮損處未發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)敲除Gal-3，可導(dǎo)致咪喹莫特誘導(dǎo)PV樣小鼠模型中PV表型加重，表皮增厚、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加；體外試驗(yàn)敲低HaCaT細(xì)胞中Gal-3表達(dá)，可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分化與遷移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抗菌肽、趨化因子配體的分泌，表明PV皮損處表皮中Gal-3表達(dá)下調(diào)可通過影響角質(zhì)形成細(xì)胞功能、促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，加重PV病情。本研究同樣發(fā)現(xiàn)PV皮損表皮中Gal-3表達(dá)明顯下調(diào)。

Gal-7在皮膚中主要表達(dá)于復(fù)層扁平上皮，調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡、增殖和遷移，影響皮膚屏障功能。角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖是PV的典型病理特征之一。Mehul等[24]采用膠帶粘貼獲取表皮角質(zhì)層提取蛋白，發(fā)現(xiàn)PV皮損角質(zhì)層中Gal-7含量明顯高于正常對(duì)照。有研究發(fā)現(xiàn)，在增殖的皮膚基底層角質(zhì)形成細(xì)胞上，Gal-7表達(dá)低于基底上層的角質(zhì)形成細(xì)胞；體外機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)JNK1-miR-203-p63通路介導(dǎo)Gal-7促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的分化、抑制增殖的過程[25]。比較Gal-7敲除小鼠與野生小鼠皮膚結(jié)構(gòu)與細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)敲除Gal-7不影響皮膚的增殖，以及基底層、棘層、顆粒層的分化和細(xì)胞間連接，但在UVB照射及外傷刺激下，Gal-7敲除小鼠表現(xiàn)出強(qiáng)烈的應(yīng)激增殖反應(yīng)[26]。 由上可知，Gal-7對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞功能的影響比較復(fù)雜。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，Gal-7主要表達(dá)于皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，且PV皮損表皮處Gal-7的表達(dá)明顯高于正常皮膚。但Gal-7在PV皮損表皮中過表達(dá)是否影響PV的發(fā)生發(fā)展還需進(jìn)一步研究。

以往研究對(duì)Gal-9的免疫調(diào)節(jié)功能的報(bào)道較多，如Gal-9作為T細(xì)胞Ig和粘蛋白結(jié)構(gòu)域分子Tim3的配基，可與Th1細(xì)胞表面的Tim-3結(jié)合，誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流和Th1細(xì)胞死亡[27]；可通過促進(jìn)IgM-BCR與CD45、CD22的共定位，抑制B細(xì)胞的活化[28]；是嗜酸性粒細(xì)胞的趨化因子，可驅(qū)化嗜酸性粒細(xì)胞的局部浸潤(rùn)[14]。但Gal-9對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的影響研究較少。Igawa等[29]發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照皮膚表皮中Gal-9高表達(dá)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中IFN-γ可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中Gal-9的表達(dá)，而PV皮損中INF-γ上調(diào)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)PV皮損表皮處Gal-9的表達(dá)明顯低于正常皮膚，故推測(cè)表皮處Gal-9的表達(dá)下調(diào)可能與過量的IFN-γ有關(guān)。但Gal-9的表達(dá)下調(diào)是否影響免疫細(xì)胞的功能，從而影響PV發(fā)病，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，Gal-1、Gal-3、Gal-7、Gal-9在PV皮損局部的細(xì)胞定位及表達(dá)變化各不相同；PV患者血清中Gal-1水平升高且與PASI評(píng)分相關(guān)，PV皮損真皮處Gal-1的表達(dá)明顯上調(diào)，提示Gal-1可能影響PV的發(fā)病過程；PV皮損表皮中Gal-3表達(dá)下調(diào)，可能通過影響角質(zhì)形成細(xì)胞功能、促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，加重PV；PV皮損表皮中Gal-7上調(diào)、Gal-9下調(diào)，但是否通過影響角質(zhì)形成細(xì)胞、免疫細(xì)胞功能介導(dǎo)PV的發(fā)病，還需深入研究。