sprouty4蛋白對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及分化的影響

黃鈺淇， 李里， 鐘維， 朱磊， 林靜霞， 張嬌， 陳永鋒1，

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524023；2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091)

sprouty蛋白是Hacohen等在1998年果蠅基因譜的研究中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，隨后在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)類似物，分別命名為sprouty1、sprouty2、sprouty3、sprouty4。sprouty4蛋白(sprouty4 protein, SPRY4)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白, 該蛋白的存在使這條信號(hào)通路被阻斷，從而起到抑制細(xì)胞過度增殖、遷移，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的作用[1]。皮膚是人體的天然免疫屏障，角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes,KC)是其中的重要成分。KC是一種不斷增殖、分化和更新的細(xì)胞，其增殖和分化過程受到多種因素影響。目前國(guó)內(nèi)外未見有關(guān)SPRY4對(duì)KC功能影響的報(bào)道。本研究探討SPRY4蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖及分化的影響，以為SPRY4調(diào)節(jié)KC研究提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

人永生化表皮細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞(BNCC100433)購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

上、下游引物(上海生工)；異丙醇(廣州化學(xué)試劑廠)；氯仿(廣州化學(xué)試劑廠)；DEPC水(上海生工)；無水乙醇(廣州化學(xué)試劑廠)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；SYBRPrimer Ex TaqTMⅡ(TaKara公司)；PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time,TaKara公司)；CCK-8試劑盒(同仁化學(xué))；FECTTM CP Transfection(銳博生物)；RNA oligo(上海生工)。Bio-rad PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司)；NanoDrop 分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 方法

1.3.1 SPRY4基因敲降 實(shí)驗(yàn)組采用合成即用型化學(xué)合成雙鏈小分子RNA(short interfering RNA，siRNA)對(duì)HaCaT細(xì)胞中的SPRY4基因進(jìn)行敲降。將HaCaT細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后按4×105個(gè)/孔鋪于6孔板，置于培養(yǎng)箱過夜使細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到50%以上；按說明書將Lipofectamine2000制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物混合液，按比例混合無血清的DMEM后加入培養(yǎng)基中；置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對(duì)照組HaCaT細(xì)胞不加任何處理。

1.3.2 RT-qPCR驗(yàn)證SPRY4蛋白敲降 于敲降后48 h后RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中SPRY4 mRNA的表達(dá)，RT-qPCR操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。計(jì)算兩組細(xì)胞中SPRY4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)通過公式計(jì)算出各組間SPRY4表達(dá)的敲降率，敲降率=1-實(shí)驗(yàn)組mRNA平均表達(dá)量/對(duì)照組mRNA平均表達(dá)量×100%。選擇敲降效果最佳的一組，按照基本相同的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 RT-qPCR檢測(cè)兩組分化標(biāo)志物Involucrin、CK1、CK10 mRNA水平 重復(fù)上述操作對(duì)HaCaT細(xì)胞中的SPRY4進(jìn)行敲降，驗(yàn)證敲降成功后，行RT-qPCR檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞48 h后Involucrin、CK1、CK10 mRNA水平。PCR反應(yīng)采用20 μL反應(yīng)體系，在無RNA酶八聯(lián)管中分別加入10 μL SYBR Prime Ex TaqTM、1 μL cDNA、7 μL DEPC水、前后引物各1 μL(表1)，實(shí)驗(yàn)條件為：預(yù)變性：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,共45個(gè)循環(huán)。比較兩組各分化標(biāo)志物的表達(dá)差異。

表1 各組引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.4 CCK-8計(jì)數(shù)法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞增殖 細(xì)胞消化重懸后計(jì)數(shù)，以5 000個(gè)/孔鋪96孔板，每孔約100 μL細(xì)胞懸液；將培養(yǎng)板置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱過夜；按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求轉(zhuǎn)染siRNA后置于培養(yǎng)箱48 h；分別于0、24、48、72 h每孔加入約10 μL CCK-8試劑，嚴(yán)格避光置于培養(yǎng)箱孵育4 h；使用酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)測(cè)定OD值(檢測(cè)波長(zhǎng)480 nm)。比較實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組HaCaT細(xì)胞中SPRY4蛋白被干擾后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 記錄各個(gè)樣本的循環(huán)閾值(cycle threshold valve, Ct),三個(gè)副孔間取平均值，ΔCt實(shí)驗(yàn)組=Ctsi-SPRY4-CtGAPDH，ΔCt對(duì)照組=Ct空白對(duì)照NC-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。最后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用2-ΔΔCt值，表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兩組間的相對(duì)倍數(shù)關(guān)系即表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各指標(biāo)mRNA水平相對(duì)表達(dá)量比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPRY4蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞分化的影響

RT-qPCR法證實(shí)，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞SPRY4 mRNA表達(dá)降低，敲降率為94.75%，表明實(shí)驗(yàn)組SPRY4基因敲降成功。進(jìn)一步檢測(cè)分化標(biāo)志物Involucrin、CK1、CK10 mRNA水平，結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞Involucrin、CK1、CK10 mRNA表達(dá)量降低(圖1)，其中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組SPRY4 mRNA水平比較，t=119.3，P<0.000 1; Involucrin mRNA水平比較，t=32.96，P=0.000 9；CK1比較，t=30.32，P=0.001 1；CK10比較，t=119.3，P<0.000 1；提示隨著SPRY4的表達(dá)降低，HaCaT細(xì)胞分化能力減弱。

圖1 siRNA轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞48 h后Involucrin、CK1、CK10 mRNA表達(dá)Fig.1 mRNA expression of Involucrin, CK1 and CK10 after transfection of siRNA into HaCaT cells for 48 h.

2.2 SPRY4蛋白對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，干擾48 h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD值差異最大，說明實(shí)驗(yàn)組由于SPRY4被敲降導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目不斷增多，且增殖速率超過細(xì)胞正常生長(zhǎng)速率，提示SPRY4的表達(dá)降低能夠促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖(圖2)。

圖2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞增殖的變化Fig.2 The changes in cell proliferation in the experimental group and the controls.

3 討論

銀屑病是由細(xì)胞免疫系統(tǒng)激活，多因素多通路作用引起的以角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖為特點(diǎn)的慢性皮膚病。銀屑病和角質(zhì)形成細(xì)胞之間的關(guān)系密切，雖然近年來有大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究，但影響角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的因素及其與銀屑病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系仍不明確。SPRY4蛋白是MAPK信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，MAPK是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶[2]，研究表明，銀屑病患者皮損處MAPK活性明顯升高，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在銀屑病的發(fā)病中起重要作用[3]。被激活的MAPK磷酸化，通過與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作用促進(jìn)血管形成，在表皮中促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答而參與銀屑病的發(fā)病過程。

SPRY蛋白作為腫瘤的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白可以在細(xì)胞水平上通過調(diào)節(jié)MAPK/ERK和其他途徑來調(diào)控增殖、分化、運(yùn)動(dòng)和存活。在功能缺失和表達(dá)減少時(shí)，細(xì)胞增殖異常導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道SPRY4蛋白在乳腺癌衍生細(xì)胞系[5]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[6]、肝門周圍膽管癌[7]等腫瘤中可以干擾細(xì)胞的增殖和遷移，并且成為評(píng)估預(yù)后的因素和潛在的治療靶標(biāo)。SPRY4蛋白在角質(zhì)形成細(xì)胞與銀屑病發(fā)病機(jī)制中可能存在重要作用，但仍需進(jìn)一步證實(shí)。

本研究顯示,采用siRNA基因敲降技術(shù)抑制HaCaT細(xì)胞中SPRY4的表達(dá)能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，由此證明SPRY4對(duì)KC增殖功能具有一定的影響。Involucrin是交聯(lián)包膜的蛋白前體,它可作為表皮角質(zhì)細(xì)胞早期分化的標(biāo)記;CK是表皮KC的主要結(jié)構(gòu)蛋白和分化的早期標(biāo)志物，隨著基底細(xì)胞分化,CK的表達(dá)可轉(zhuǎn)變?yōu)镃K1及CK10[8]。因此，采用相同實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)HaCaT細(xì)胞分化指標(biāo)Involucrin、CK1與CK10進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)SPRY4表達(dá)降低的情況下，HaCaT細(xì)胞分化功能被同向抑制。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞層面初步證實(shí)了SPRY4蛋白與角質(zhì)形成細(xì)胞之間存在相關(guān)性，為后續(xù)開展銀屑病的通路和治療靶點(diǎn)研究提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和研究思路。未來需進(jìn)一步研究SPRY4蛋白是否通過MAPK通路在角質(zhì)形成細(xì)胞中對(duì)銀屑病發(fā)揮調(diào)控作用，并開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究SPRY4蛋白在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型中對(duì)KC的增殖、分化的影響，為銀屑病的治療靶點(diǎn)提供新思路。