新型含釓磁共振對比劑在小鼠體內(nèi)的成像研究

劉 杰，朱靈梅，張文飛

1重慶北部寬仁醫(yī)院放射科，重慶 401121；2重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院放射科，重慶 401121

磁共振對比劑（MRI CAs）通過改變體內(nèi)局部組織中水質(zhì)子的弛豫時(shí)間，提高正常組織與病灶的成像對比度，從而使MRI能更敏感地檢測微小病灶或特異性病灶［1-2］。目前，臨床上多使用小分子磁共振對比劑（DTPA-Gd），其存在著弛豫率低、代謝速度快、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短的缺陷，不足以滿足臨床所有診斷的需要［3-5］，因此，研發(fā)新的高弛豫率、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長的磁共振對比劑顯得尤為重要。既往研究中，將小分子Gd3+基對比劑負(fù)載于大分子載體材料上獲得相應(yīng)的大分子Gd3+基對比劑是目前最有效的策略之一［6］。與小分子Gd3+基對比劑相比大分子Gd3+基對比劑擁有更大的尺寸［7］，能夠有效延緩整個(gè)分子的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，增加其旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間，從而顯著提高縱向弛豫率［8-9］。然而，大分子Gd3+基對比劑在體內(nèi)的長時(shí)間循環(huán)會(huì)逐漸釋放出Gd3+，帶來不容忽視的毒性問題，同時(shí)大分子載體材料本身的滯留沉積也存在一定的毒性風(fēng)險(xiǎn)［10-11］。為解決大分子磁共振對比劑的潛在毒性問題，本研究將小分子Gd3+螯合物通過化學(xué)鍵連接到生物可降解的大分子材料上面，能夠在滿足高縱向弛豫率和足夠成像窗口時(shí)間的前提下，促進(jìn)小分子Gd3+螯合物從大分子結(jié)構(gòu)中快速釋放出來并經(jīng)腎臟排泄，可以有效避免在Gd3+體內(nèi)的長時(shí)間滯留，從而顯著降低其引起毒性的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康的雌性BALB/c小鼠20只（8～10周，體質(zhì)量20±2 g，重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南，并經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 材料合成

臨床醫(yī)用DTPA-Gd（西安瑞禧生物科技有限公司）和大分子含釓磁共振對比劑Gd-PPF-S-CAs（重慶大學(xué)生物材料學(xué)院研制），Gd3+濃度為5.43 g/L，具有酶降解特性。

1.3 材料體外弛豫率檢測

配制含不同Gd3+濃度（0～0.4 mmoL）的Gd-PPF-SCAs、DTPA-Gd水溶液。在室溫下，使用GE SIGNA Creator 1.5 T MRI掃描儀的T1WI SE序列對這些溶液進(jìn)行掃描，并通過它們的T1WI MR圖像獲取相應(yīng)的1/T1值。然后作出1/T1值隨Gd3+濃度變化的直線，該直線的斜率為相應(yīng)對比劑的縱向弛豫率(r1)。

1.4 MRI檢查

裝備有小鼠線圈的臨床GE SIGNA Creator 1.5 T MRI用于MR成像并采用多段單回波T1WI SE序列，其參數(shù)為：TR=400 ms，TE=14 ms，slices=12，slices gap=1.2 mm，voxel size=0.2 mm×0.2 mm×1.5 mm，F(xiàn)OV=60 mm。在注射對比劑前，先對正常小鼠主要代謝器官（肝、腎、膀胱）進(jìn)行平掃，所得的MR成像信號(hào)強(qiáng)度（SI）定義為SI注射前。隨機(jī)將正常Balb/C小鼠分為兩組，經(jīng)尾靜脈分別將DTPA-Gd、Gd-PPF-S-CAs注射入小鼠體內(nèi)，且Gd3+注射濃度均為0.08 mmol/kg，注射劑量為200 μL/只。分別于注射前和注射后10 min及0.5、1、2、4、8 h獲取MR圖像及SIs，這些SIs定義為SI注射后。MRI信號(hào)強(qiáng)度的相對增強(qiáng)值（SI%）定義為（SI注射后/SI注射前）×100%。

1.5 病理分析

按Gd3+劑量為0.08 mmol/kg MR成像劑量經(jīng)尾靜脈將Gd-PPF-S-CAs注射入健康雌性BALB/c（20±2 g，8～10周）小鼠體內(nèi)，同時(shí)使用生理鹽水作為對照。注射后24 h處死動(dòng)物，解剖分離出體內(nèi)一些主要器官，包括心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟，對它們進(jìn)行H&E染色和組織學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢查

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)比較組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外弛豫率

在相同的Gd3+濃度下兩組MRI對比劑的強(qiáng)化存在差異，肉眼觀察磁共振大分子對比劑信號(hào)強(qiáng)度顯著高于臨床使用的DTPA-Gd，通過改變T1WI SE序列中的TR時(shí)間對兩種對比劑進(jìn)行弛豫率的測定，顯示Gd-PPF-SCAs的r1值為15.43 mmoL-1s-1，約是臨床用DTPA-Gd r1值（3.53 mmoL-1s-1）的5倍（圖1）。

2.2 Gd-PPF-S-CAs的體內(nèi)主要器官成像

尾靜脈注射MRI對比劑Gd-PPF-S-CAs后，肝、腎和膀胱主要器官信號(hào)強(qiáng)度逐漸增加，但增強(qiáng)趨勢各不相同（圖2），注射后30 min內(nèi)，肝、腎兩個(gè)主要器官M(fèi)RI信號(hào)強(qiáng)度迅速增加，肝臟在1 h達(dá)到強(qiáng)化峰值，增強(qiáng)幅度為153%；隨后強(qiáng)化程度下降，8 h觀察仍然有強(qiáng)化。而腎臟進(jìn)入持續(xù)強(qiáng)化階段，2 h達(dá)到強(qiáng)化峰值，增強(qiáng)幅度為167%，8 h后強(qiáng)化程度開始緩慢下降。膀胱在注射后10 min開始出現(xiàn)顯著強(qiáng)化，隨后進(jìn)入持續(xù)強(qiáng)化，增強(qiáng)幅度為754%，8 h強(qiáng)化程度降低。而注射臨床DTPA-Gd后，肝、腎這兩個(gè)主要器官在10 min左右達(dá)到強(qiáng)化峰值，30 min后強(qiáng)化程度下降，而膀胱則在4 h時(shí)強(qiáng)化程度也明顯下降，其MRI增強(qiáng)效果和成像時(shí)間明顯不如Gd-PPF-S-CAs（圖3）。Gd-PPF-S-CAs在肝、腎內(nèi)能達(dá)到更為顯著的增強(qiáng)效果，組織對比度高，成像窗口時(shí)間長。

2.3 病理結(jié)果

組織學(xué)分析結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組相比，注射了Gd-PPF-CAs的實(shí)驗(yàn)組未發(fā)現(xiàn)對小鼠的主要器官（心、肝、脾、肺、腎）產(chǎn)生明顯的毒性作用，也未觀察到病理學(xué)異常，如壞死、萎縮、炎性浸潤等（圖4）。

3 討論

將小分子Gd3+基對比劑負(fù)載于大分子載體材料上獲得相應(yīng)的大分子Gd3+基對比劑是目前解決小分子DTPA-Gd固有不足的有效方式之一［12］，然而，大分子Gd3+基對比劑在體內(nèi)的長時(shí)間循環(huán)會(huì)逐漸釋放出Gd3+，帶來不容忽視的毒性問題，同時(shí)大分子載體材料本身的滯留沉積也存在一定的毒性風(fēng)險(xiǎn)［13-15］。針對以上問題，在大分子結(jié)構(gòu)中引入環(huán)境敏感型（pH敏感、酶敏感、氧化還原敏感等）的化學(xué)組分［16-17］，賦予Gd3+基大分子對比劑良好的可生物降解性，使其在高效磁共振成像后逐漸降解為可經(jīng)腎臟排泄的低相對分子質(zhì)量Gd3+螯合物及其它分子碎片，從而顯著降低其毒副作用［18］。針對此解決方法，本研究將小分子Gd3+螯合物通過各種可生物降解的化學(xué)鍵連接到可生物降解的大分子載體材料上，同時(shí)，利用人體內(nèi)各組織、器官中均存在大量的酶［19］，設(shè)計(jì)材料具有酶降解特性，從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)物質(zhì)的降解和代謝，使材料能夠在顯著提高M(jìn)RI成像對比度的同時(shí)，有效改善含釓磁共振對比劑存在的毒性問題，促進(jìn)Gd3+或有毒載體材料的代謝清除，從而降低含釓磁共振對比劑引起毒性的風(fēng)險(xiǎn)。

3.1 弛豫率分析

T1型對比劑的弛豫效能主要來源于順磁性物質(zhì)和鄰近水質(zhì)子之間的偶極相互作用，進(jìn)而來增強(qiáng)MR圖像的對比度［20］。這一作用范圍可分為3球?qū)樱簝?nèi)球?qū)觾?nèi)Gd3+直接與水分子配位結(jié)合，這一層對水質(zhì)子弛豫速率的增加稱為（1/T1）IS；第二球?qū)樱⊿S）內(nèi)水分子與螯合物分子配位結(jié)合，這一層對水質(zhì)子弛豫速率的增加稱為（1/T1）SS；外球?qū)樱∣S）內(nèi)擴(kuò)散到磁性分子附近的水分子也會(huì)發(fā)生弛豫現(xiàn)象，這一層對水質(zhì)子弛豫速率的增加稱為（1/T1）OS。T1型對比劑對水質(zhì)子弛豫速率1/T1的增加為三者之和，而內(nèi)球?qū)訉λ|(zhì)子弛豫速率的增加是最主要的［21-22］。影響（1/T1）IS的最主要因素為：直接與順磁中心配位結(jié)合的水分子的數(shù)目、配位水分子的平均滯留時(shí)間、整個(gè)對比劑分子的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間。通常，增加水分子數(shù)目、旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間和適當(dāng)?shù)乜s短平均滯留時(shí)間都會(huì)提高水質(zhì)子的弛豫率［22］。

將小分子MRI CAs負(fù)載于在大分子載體材料上，形成大分子MRI CAs，其最重要的作用就是影響旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間［23］。相比于小分子CAs，分子結(jié)構(gòu)大的大分子MRI CAs產(chǎn)生的空間位阻大，這樣可以有效延緩其分子旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，從而增加旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間，最終使r1大幅增加。在本組研究中由于Gd-PPF-S-CAs有著很大的相對分子質(zhì)量和水相粒徑，能更有效阻礙分子的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，從而延長分子旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間，根據(jù)Solomom-Bloembergen-Morgan理論，旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間的增加會(huì)引起縱向弛豫率的提高［24］。

3.2 體內(nèi)正常器官成像

Gd-PPF-S-CAs在肝、腎和膀胱這3個(gè)主要器官內(nèi)能達(dá)到更為顯著的增強(qiáng)效果，組織對比度高，成像窗口時(shí)間長，8 h觀察肝臟仍有強(qiáng)化，分析原因主要為：（1）肝臟內(nèi)含有大量的Kupffer細(xì)胞，本身對大分子有攝取，因此大分子物質(zhì)具有肝臟靶向聚集作用；（2）在本研究設(shè)計(jì)的材料中，該共聚物主鏈含有酶敏感鍵，相較于其它大分子材料，Gd-PPF-S-CAs由于具有酶降解特性，可以被肝臟中的酶（如酯酶或組織蛋白酶）所降解，酶降解的速率較慢，因此增加了該對比劑的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，保證了有效的成像窗口時(shí)間。而腎臟和膀胱的信號(hào)則從注射后開始一直持續(xù)增強(qiáng)，8 h觀察仍有強(qiáng)化，以上結(jié)果說明，Gd-PPF-S-CAs能夠在體內(nèi)被降解并釋放小分子Gd3+螯合物，并及時(shí)地經(jīng)腎臟清除體外，避免了Gd3+螯合物在體內(nèi)長時(shí)間的滯留所帶來的潛在毒性可能，保證了實(shí)驗(yàn)組材料的安全性。

3.3 材料毒性分析

既往研究表明，電正性的大分子通常具有明顯的細(xì)胞毒性、血液毒性以及補(bǔ)體激活功能，而電負(fù)性和電中性的大分子的細(xì)胞毒性則較低［25］。本研究中，注射Gd-PPF-S-CAs 24 h后觀察小鼠主要器官并無損傷表現(xiàn)，這一結(jié)果表明Gd-PPF-S-CAs對活體動(dòng)物的器官和組織無毒性作用，具有的良好的生物相容性，這與材料本身所具備的可降解性以及表面所帶負(fù)性電荷性質(zhì)等有關(guān)。

綜上所述，Gd-PPF-S-CAs在體外具有較高的弛豫效能，在體內(nèi)能夠顯著提高正常器官的MRI成像的對比度，并且在完成體內(nèi)成像后，可被降解為可排泄的低相對分子質(zhì)量碎片，顯著降低因Gd3+滯留體內(nèi)而引發(fā)毒性的風(fēng)險(xiǎn)。