基質(zhì)蛋白酶-10 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

彭根遠(yuǎn)， 周 潔， 陳 托， 李 海， 鞏發(fā)海， 孫書豪

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科，銀川 750004）

結(jié)直腸癌是常見癌癥之一，全球每年死亡例數(shù)超過693900 例[1]。是中國排名第四位的惡性腫瘤，且發(fā)病率有逐年上升趨勢[2]。自20 世紀(jì)90 年代人們發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶類（MMPs）能促進(jìn)腫瘤組織的血管生成，促使腫瘤組織的生長和轉(zhuǎn)移，激發(fā)了研究者們對(duì)MMPs 研究的興趣[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌癥患者血清表達(dá)MMP-10 者常預(yù)后不良[5]，有學(xué)者研究消化道腫瘤發(fā)現(xiàn)MMP-10能夠通過調(diào)控鈣離子通道促進(jìn)消化道腫瘤的發(fā)展[6]，腫瘤細(xì)胞通過分泌各種酶類降解細(xì)胞外基質(zhì)，向周圍及遠(yuǎn)處組織侵襲轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤微血管生成，其中最重要的是基質(zhì)金屬蛋白酶類[7]。推測MMP-10 可能參與了結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）及免疫組織化學(xué)染色方法檢測結(jié)直腸癌、癌旁以及正常結(jié)直腸組織中MMP-10 蛋白及mRNA 的表達(dá)情況，并研究其與患者臨床病理特征的關(guān)系，分析MMP-10 在結(jié)直腸癌中的可能作用及臨床意義。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

標(biāo)本組織源于 2018 年3—12 月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科手術(shù)獲取的結(jié)腸癌或直腸癌組織40 例和相對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距離癌組織中心≥4 cm）以及相對(duì)正常的結(jié)腸或直腸組織（距離癌組織中心≥8 cm 或大腸癌標(biāo)本切口緣最遠(yuǎn)端）標(biāo)本；所有患者術(shù)后均由寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科確診為結(jié)直腸癌。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療，年齡 43～83 歲，平均（61.37±11.45）歲；男 22 例、女 18 例；直腸癌 26 例、結(jié)腸癌 14 例。

1.2 主要試劑和儀器

全蛋白提取試劑盒（凱基生物）、5×SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液（凱基生物）、BCA 蛋白含量測試試劑盒（凱基生物）、彩色蛋白Marker（凱基生物）、PVDF 膜（ImmobilonRTransfer Membranes）；Trizol（Invitrogen 公司）、反轉(zhuǎn)錄 cDNA試劑盒（Thermo Fisher，貨號(hào) 00118088）、SYBRR Select Master Mix（Thermo Fisher，貨號(hào) 4472908）；兔抗人MMP-10 多克隆抗體（abcam，貨號(hào)ab38930）、內(nèi)參兔抗β-actin（abcam，貨號(hào)ab8227）兔二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋，貨號(hào)P6001）、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋）；正置熒光顯微鏡（Leica）、NICON 圖像采集系統(tǒng)（日本 NICON）、Bio-rad IQ5 qPCR 儀器等。

1.3 Western blot 測定結(jié)直腸組織中MMP-10 蛋白的表達(dá)

分別研磨結(jié)直腸癌、癌旁、正常組織后加入全蛋白提取試劑，充分裂解后1200 r·min-1離心10 min，取上清，用BCA 蛋白含量測試試劑盒（凱基生物）測其濃度，按1∶4 的比例加入蛋白上清緩沖液，100℃加熱5 min，存放于-20℃待用。現(xiàn)配10%的SDS-PAGE 膠，按濃度加樣，80V 電壓15 min，120 V 電壓 90 min，取膠 100 V 電壓轉(zhuǎn)膜90 min，取膜，TBST 緩沖液沖洗 1 次，5%的脫脂牛奶封閉 90 min，TBST 沖洗 3 次，每次 10 min，在濃度為4000∶1 的一抗工作液中 4℃孵育過夜，TBST緩沖液沖洗3 次，每次10min，室溫孵育二抗（2000∶1）90 min，TBST 緩沖液沖洗 3 次，每次10 min，加入適宜的ECL 顯色液反應(yīng)1 min后在凝膠成像系統(tǒng)曝光，拷貝曝光的條帶。重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，將掃描后的圖片用Image J 圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析，采用目的條帶均值灰度值（IOD）/內(nèi)參條帶均值IOD 表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。并使用GraphPad 6.0 軟件統(tǒng)計(jì)作圖。

1.4 qPCR 測定結(jié)直腸組織中MMP-10 mRNA的表達(dá)

分別研磨結(jié)直腸癌、癌旁和正常組織后加入Trizol 裂解液充分裂解，氯仿分離RNA，等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，棄上清液，75%乙醇清洗2 次RNA 沉淀，混勻后離心，加入適量DEPC 水溶解沉淀。然后酶標(biāo)儀檢測260 和280 nm波長處的光密度（OD）值，測定RNA 溶液濃度和純度。12 μL 體系加樣后在Bio-Rad PCR 儀器上機(jī)（65℃加熱 5 min，冰浴），20 μL 體系 Bio-Rad PCR 儀器上機(jī)（42℃加熱 60 min，70℃加熱 5min）合成cDNA。其中MMP-10 引物：上游5'TTTGGCTCATGCCTACCCAC3'；下游 5'TCTTGCGAAAGGGC GGAACTG3'；內(nèi)參 GADPH 引物：5'ACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG3'，5'GTCAAAGGTGGAG GAGTGGGT3'。參照 SYBRRSelect Master Mix 說明書20 μL 體系加樣，重復(fù)加樣2 個(gè)孔，以GAPDH為內(nèi)參，在Bio-rad IQ5 qPCR 儀器上檢測［95℃預(yù)變性 2 min，95 ℃變性 10 s，58℃退火 32 s、72 ℃延伸 30 s，95 ℃ 60 s、95 ℃ 60 s、55 ℃～98 ℃（10 s/cycle 0.5 ℃/cycle）86 cycles］，導(dǎo)出excel 表格數(shù)據(jù)，采用 2-△△Ct計(jì)算結(jié)果：△△Ct=癌組（Ct-Ct空白）/癌旁組（Ct-Ct空白）-正常組（Ct-Ct空白）。并使用GraphPad 6.0 軟件統(tǒng)計(jì)作圖。

1.5 免疫組織化學(xué)法（IHC）測定結(jié)直腸組織中MMP-10 表達(dá)

分別將結(jié)直腸癌、癌旁、正常組織石蠟包埋固定，切片，烤片3 h 后進(jìn)行透明、脫水，檸檬酸鹽高壓修復(fù)后3% H2O2室溫孵育消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，10%正常山羊血清封閉后滴加一抗 MMP-10（1∶300）工作液，4 ℃下孵育過夜，抗兔二抗孵育1 h，蘇木素染色、鹽酸酒精分化、清水反藍(lán)，脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片，于Leica 正置顯微鏡下觀察并拍照。所得結(jié)果由病理科醫(yī)師在100 倍鏡下隨機(jī)觀察10 個(gè)視野進(jìn)行判定。根據(jù)著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)分別計(jì)分后，按這2 項(xiàng)計(jì)分之和得最終結(jié)果，兩項(xiàng)指標(biāo)值相加總評(píng)分≥4 分的為MMP-10 蛋白表達(dá)陽性，＜4 分則為MMP-10 蛋白表達(dá)陰性。其染色強(qiáng)度可分為：陰性（-）：無染色，0 分；弱（+）：淡黃色，1 分；中（++）：棕黃色，2 分；強(qiáng)（+++）：棕褐色，3 分。IHC 染色后細(xì)胞數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：染色細(xì)胞數(shù)所占同類型細(xì)胞數(shù)的百分比＜30%的為1 分；30%～60%為 2 分；＞60%為 3 分。使用 GraphPad 6.0 軟件統(tǒng)計(jì)作圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用例或率（%）表示，各組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸正常組織、癌旁組織、癌組織中MMP-10 蛋白的表達(dá)情況

Western blot 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌旁組織、癌組織中MMP-10 蛋白表達(dá)水平均高于結(jié)直腸正常組織（P 均＜0.05），同樣癌組織中MMP-10 mRNA 及其蛋白表達(dá)水平均高于癌旁組織（P 均＜0.05）。見圖 1。

2.2 結(jié)直腸癌患者腸組織中MMP-10 陽性表達(dá)情況

IHC 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：40 例正常組織中MMP-10陽性為3 例（7.5%），40 例癌組織中為25 例（62.5%），40 例癌旁組織中為16 例（40.0%），癌組織的陽性表達(dá)率高于癌旁組織（χ2=25.593，P=0.000），癌旁組織的陽性表達(dá)率高于正常組織（χ2=11.665，P=0.001）。結(jié)直腸癌組織中MMP-10 主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，并且可向細(xì)胞外分泌，染色為棕褐色，呈中等或強(qiáng)陽性表達(dá)，而癌旁組織及正常組織中MMP-10 呈弱陽性或陰性表達(dá)。見圖2。

2.3 MMP-10 與結(jié)直腸癌患者不同臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析

以免疫組化結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：MMP-10 的表達(dá)與結(jié)直腸癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.343，P＜0.05）、與 TNM 分期成正相關(guān)（r=0.412，P＜0.05）、與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.529，P＜0.05）。MMP-10 與臨床病理特征間的關(guān)系顯示，在結(jié)直腸癌分化程度、TNM 分期（T1～T2、T3～T4、N0～N1、N2～N3）、臨床分期（Ⅰ+Ⅱ期與Ⅲ+Ⅳ期比較）、轉(zhuǎn)移與否進(jìn)行比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.05）；患者的年齡、性別、病理學(xué)類型、腫瘤大小、部位比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。見表1。

表1 MMP-10 與結(jié)直腸癌患者的臨床病理的關(guān)系（例）

2.4 結(jié)直腸癌患者不同部位的組織中MMP-10 mRNA 表達(dá)情況

qPCR 檢測結(jié)果顯示：癌組織中 MMP-10 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織（P<0.05），癌旁組織中的MMP-10 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于正常組織（P<0.05）。見圖 3。

3 討論

在美國，結(jié)直腸癌是癌癥死亡的第三大原因[8]。MMP 蛋白酶家族參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，可促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]?；|(zhì)金屬蛋白酶是一組Zn2+、Ca2+依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶家族，可由成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞合成和分泌，能降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分和一些非基質(zhì)蛋白，多種腫瘤組織中有MMPs 表達(dá)，參與腫瘤進(jìn)展、血管生成、周圍組織侵襲和轉(zhuǎn)移灶的形成，并逃避免疫系統(tǒng)。眾所周知，目前已有26 種MMPs 成員被發(fā)現(xiàn)。

對(duì)基底細(xì)胞癌（BCC）和鱗狀細(xì)胞癌（SCC）活檢標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，MMP-10 在腫瘤上皮和間質(zhì)細(xì)胞中呈高表達(dá)，并且隨鱗癌級(jí)別的增高M(jìn)MP-10 的表達(dá)也增高[10]。同樣在食管癌[11-13]、胃癌[14]、肝細(xì)胞癌[15]、宮頸癌卵巢癌[16-17]中也發(fā)現(xiàn)MMP-10 的高表達(dá)，支持MMP-10 在人類腫瘤進(jìn)展中的作用。Tiwari 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常人體中，大腸癌患者血清中MMP-7、MMP-10、MMP-12 的表達(dá)更高，且表達(dá)水平與總體存活率呈負(fù)相關(guān)。MMP-10 主要通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖遷移能力[12，19]、血管增生[20]，細(xì)胞凋亡[16，21-22]這三個(gè)途徑影響癌癥的發(fā)生發(fā)展。實(shí)體癌侵入周圍組織的主要步驟之一是細(xì)胞外基質(zhì)中組織屏障的降解，血管生成和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，主要是由于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）之間的動(dòng)態(tài)平衡破壞[22]。在人口腔鱗狀細(xì)胞癌中，TGF-β1 誘導(dǎo)的HSC-4 細(xì)胞侵襲性受到MMP-10 小干擾 RNA（si RNA）的抑制[23]。在食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）中將AJUBA 鑒定為推定的癌癥基因，使用RNA 測序揭示涉及的AJUBA 的致癌途徑，發(fā)現(xiàn)AJUBA 是通過激活ERK1/2 來上調(diào)MMP10 和 MMP13 的水平[4]。

本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌患者的癌組織、癌旁組織、正常組織中MMP-10 蛋白的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，呈依次降低趨勢。MMP-10 作為參加結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的重要因子，其可能通過TGFβ-1 參與調(diào)控EMT 通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲，同時(shí)MMP-10 也受VEGF 的調(diào)控，在MMPs之間，MMP-10 促使 MMP-9 和 MMP-2 的分泌，推測MMP-10 可能受VEGF 調(diào)控，影響MMP-9和MMP-2，調(diào)節(jié)血管的增生，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究著眼在結(jié)直腸癌患者組織中MMP-10 蛋白的表達(dá)來驗(yàn)證其與結(jié)直腸癌的關(guān)系，重點(diǎn)闡明MMP-10 與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究其在結(jié)直腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用。在結(jié)直腸癌中，MMP-10 的具體作用機(jī)制尚無明確定論，需要我們進(jìn)一步深入研究證明。

綜上表明，MMP-10 可能有促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展的作用，甚有可能成為腫瘤免疫預(yù)防和治療提供一個(gè)新方向、新思路，其具體的臨床應(yīng)用仍有待進(jìn)一步的探討。