Mex3c 參與調(diào)控小鼠下丘腦Arc、VMH 神經(jīng)核團(tuán)C-FOS表達(dá)的作用

霍 泉， 孫東君， 李 婷， 孫 婷， 杜 勇

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生物樣本庫，銀川 750004； 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院小兒外科，銀川 750004）

秀麗隱桿線蟲肌肉表達(dá)物3（Mex3c）是從線蟲到人類的保守RNA 結(jié)合蛋白，是一種含有hnRNPK 同源的（KH）RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 RNA 結(jié)合蛋白[1]，其含有E3 泛素連接酶，參與調(diào)控pal-1，rme-2 和 nos-2 等靶 RNA，相關(guān)研究報道[2-5]，Mex3c 基因可導(dǎo)致遺傳易感的高血壓病、控制惡性腫瘤中RNA 的不穩(wěn)定性、通過促進(jìn)能量消耗，減少機(jī)體脂肪的堆積。課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，Mex3c 在突變的小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的負(fù)能量平衡作用。C-FOS 蛋白（原癌基因表達(dá)產(chǎn)物）作為神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子，可通過廣泛的跨突觸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄刺激快速誘導(dǎo)，在生理、環(huán)境、藥理學(xué)和其他應(yīng)激刺激下成為急性神經(jīng)元激活的有力和有效的標(biāo)志[7-8]，正常生理條件下，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中只有基礎(chǔ)水平的表達(dá)，參與細(xì)胞的生長、信息傳遞的功能，在能量平衡的研究中，瘦素等多種參與能量平衡調(diào)控的信號也是通過誘導(dǎo)突觸后C-FOS 表達(dá)進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的[9-10]。為了深入研究Mex3c 和C-FOS 在神經(jīng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)系，本研究采用Mex3c 基因敲除小鼠，通過給小鼠注射瘦素（引起負(fù)能量平衡效應(yīng)）和饑餓激素（引起正能量平衡效應(yīng)），誘導(dǎo)參與能量平衡的信號通路的神經(jīng)元表達(dá)C-FOS，通過檢測CFOS 在這些刺激下的表達(dá)情況，為Mex3c 調(diào)控能量平衡的機(jī)制提供解剖學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

正常和Mex3c-/+FVB 的8 周齡小鼠各15 只購自賽業(yè)生物有限公司、尼氏染色試劑盒購自凱基生物有限公司、C-FOS 小鼠抗小鼠IgG1 抗體、瘦素（Leptin）購自Proteintech 公司、小鼠二步法檢測試劑盒PV-9002、DAB 顯色液購自中杉金橋公司、饑餓激素（Ghrelin）購自Tocris 公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 正常和Mex3c-/+FVB的8 周齡小鼠各15 只，隨機(jī)均分為6 個組，每組5只。正常對照組：每只小鼠按體質(zhì)量給予生理鹽水 1 μL·g-1腹腔注射；正常瘦素組：每只小鼠按體質(zhì)量給予瘦素5 μg·g-1腹腔注射；正常饑餓激素組：每只小鼠按體質(zhì)量給予饑餓激素1 μg·g-1腹腔注射；Mex3c-/+對照組、Mex3c-/+瘦素組、Mex3c-/+饑餓激素組小鼠注射干預(yù)也采取腹腔注射。

1.2.2 取腦組織及石蠟包埋 在對生理鹽水組、瘦素組、饑餓激素組腹腔注射2 h 后，以1%戊巴比妥鈉（0.05 mg·g-1）腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，剪開左心房，從右心室或右心房以生理鹽水20 mL 沖洗至組織黏膜泛白，左心室流出液體清亮后繼續(xù)以4%多聚甲醛10 mL 灌注，緩慢注射，10 min 完成為宜。順著顱骨縫破開顱骨，小心完整取出腦組織，以4%多聚甲醛固定24 h。固定結(jié)束后，用刀片將腦組織修整至理想位置，以新鮮配置的PBS 溶液置于搖床上，緩慢晃動，洗滌腦組織1 h/次，共6 次。梯度酒精脫水（酒精濃度依次為 70%、80%、90%、95%、100%、100%），二甲苯透明至腦組織透亮后以65 ℃融化的石蠟Ⅰ、Ⅱ中浸蠟2 h，包埋后備用。

1.2.3 石蠟切片的HE 染色和尼式體染色 利用震動切片機(jī)對包埋好的腦組織進(jìn)行厚度為4 μm的冠狀切片，參考小鼠腦立體定位圖譜（第二版）[11]切至下丘腦弓狀核（Arc）、背內(nèi)側(cè)核團(tuán)（VMH）位置，65 ℃烤箱烘烤 2 h。（1）HE 染色：常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蒸餾水浸泡1 min，放入0.5%蘇木精染液中3 min、1%鹽酸酒精分化、0.5%伊紅染液中染色2 min、經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠Arc、VMH中神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)變化。（2）尼式染色：對切片進(jìn)行脫蠟水化后以新鮮配置的PBS 溶液清洗3 min/3 次，經(jīng) 1%甲苯胺藍(lán) 37 ℃浸染40 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察Arc、VMH 神經(jīng)核團(tuán)中尼式小體染色結(jié)果。

1.2.4 小鼠下丘腦Arc、VMH 免疫組化染色 烘烤后的切片常規(guī)脫蠟、水化、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液高壓修復(fù)10 min、3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶、山羊血清封閉后滴加小鼠來源的C-FOS一抗（1∶300），37 ℃1 h 或者 4 ℃過夜，PBS 清洗后參考二抗說明書按照試劑盒說明書滴加二抗，DAB 顯色后蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察、拍照。利用ImageJ 軟件分析每只小鼠3 個視野下400 倍相同面積陽性細(xì)胞表達(dá)百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗，P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常、Mex3c-/+小鼠腦組織大體形態(tài)學(xué)觀察

解剖后肉眼見，正常、Mex3c-/+小鼠全腦組織大小、形狀相近，外形結(jié)構(gòu)光滑，無明顯梗死、出血及液化壞死灶等病理變化，見圖1。

2.2 各組小鼠腦組織HE 染色觀察Arc、VMH 神經(jīng)核團(tuán)解剖形態(tài)

各組小鼠腦組織Arc、VMH 神經(jīng)核團(tuán)的HE染色結(jié)果均可見各核團(tuán)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞排列密集，大量簇?fù)恚藞F(tuán)組織細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞胞漿染色較為致密，未見受損、變性、壞死的神經(jīng)元，組織染色均勻一致，解剖結(jié)構(gòu)明確清晰，病理學(xué)染色正常小鼠和Mex3c-/+小鼠未見明顯差異。見圖 2～4。

2.3 各組小鼠腦組織尼式染色觀察Arc、VMH神經(jīng)核團(tuán)尼式小體和神經(jīng)元

利用甲苯胺藍(lán)尼氏體染色試劑盒對正常、Mex3c-/+小鼠腦組織Arc、VMH 神經(jīng)核團(tuán)染色見神經(jīng)元細(xì)胞核明顯藍(lán)染，顏色較深，胞質(zhì)為淡藍(lán)色，可見均勻分布于核周細(xì)胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)色深染的尼氏體，不同神經(jīng)元中尼氏體染色或深或淺，或見于胞質(zhì)或位于細(xì)胞周邊。各組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)大而圓，在Arc、VMH 核團(tuán)內(nèi)大量存在，未見核溶解、核固縮現(xiàn)象，無明顯空泡狀?？梢奙ex3c-/+不會導(dǎo)致小鼠腦組織發(fā)育異常。見圖5、6。

2.4 各組小鼠腦組織免疫組化染色觀察Arc 神經(jīng)核團(tuán)C-FOS 表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，正常對照組小鼠下丘腦Arc 核團(tuán)中C-FOS 蛋白表達(dá)量較低，在注射瘦素和饑餓激素2 h 后表達(dá)量均升高（P＜0.05）；Mex3c-/+對照組與正常對照組相比，C-FOS 的表達(dá)量升高（P＜0.05），與正常瘦素組小鼠相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；給予饑餓激素干預(yù)后，Mex3c-/+小鼠C-FOS 的表達(dá)量低于Mex3c-/+對照組（P＜0.05）。正常瘦素和饑餓激素組與Mex3c-/+對照、瘦素組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05）。見圖 7、8。

2.5 各組小鼠腦組織免疫組化染色觀察VMH神經(jīng)核團(tuán)C-FOS 表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：腹腔注射干預(yù)后，正常小鼠瘦素和饑餓激素組VMH 核團(tuán)中的CFOS 蛋白表達(dá)量高于對照組（P＜0.05）；Mex3c-/+對照和正常瘦素組小鼠C-FOS 表達(dá)均較高，與Arc核團(tuán)相似；饑餓激素干預(yù)后的Mex3c-/+小鼠CFOS 的表達(dá)量高于正常對照組（P＜0.05）。正常瘦素和饑餓激素組與Mex3c-/+對照、瘦素組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞0.05）。見圖 9、10。

3 討論

能量平衡取決于食物攝入調(diào)節(jié)和能量消耗之間的平衡，下丘腦室旁核（PVN）、Arc、內(nèi)側(cè)核（DMN）、VMN 和外側(cè)區(qū)（LHA）等下丘腦核，通過影響食欲的神經(jīng)機(jī)制，對調(diào)節(jié)能量平衡至關(guān)重要[12-13]。本實驗結(jié)果驗證了C-FOS 蛋白可作為神經(jīng)元廣泛被激活的標(biāo)志，腦組織在基礎(chǔ)條件下C-FOS 的轉(zhuǎn)錄為低水平，在給予瘦素、饑餓激素或者其他正負(fù)能量平衡干預(yù)后下丘腦核團(tuán)CFOS 的表達(dá)量會增加[9-10，14-16]。

Mex3c 在線蟲胚胎期通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)重要mRNA 的轉(zhuǎn)錄參與其早期發(fā)育過程，但是在哺乳動物中該基因的功能尚且研究不足。Jiao 等[4]的研究表明，Mex3c 抗體被識別于小鼠體內(nèi)不同蛋白，表明Mex3c 基因可以翻譯不止一種蛋白質(zhì)。由于Mex3c-/-小鼠缺乏Mex3c 會導(dǎo)致出生后生長遲緩和圍產(chǎn)期死亡，從而發(fā)現(xiàn)了Mex3c 蛋白在促進(jìn)IGF1 mRNA 翻譯中起著重要的作用。Mex3c雜合和純合突變小鼠均可見較正常對照小鼠低水平的血糖和血脂，在研究Mex3c 和Leptin 雙突變的小鼠生長中，肥胖和生長遲緩與ob/ob 小鼠相似，多方位驗證了Mex3c 參與了能量平衡的調(diào)控[5，17-18]。

對正常小鼠和Mex3c-/+給予不同干預(yù)的實驗中，由于C-FOS 作為快速反應(yīng)蛋白，機(jī)體接受刺激后90～120 min 內(nèi)快速表達(dá)并達(dá)到高峰[19]，因此本研究采取腹腔給藥2 h 后麻醉小鼠取出腦組織。結(jié)果顯示，正常對照組小鼠Arc 和VMH 的C-FOS 均為低表達(dá)，而注射瘦素（引起負(fù)能量平衡效應(yīng)）和饑餓激素（引起正能量平衡效應(yīng)）后，Arc 和VMH 核團(tuán)C-FOS 表達(dá)量上調(diào)，驗證了CFOS 參與了下丘腦能量平衡的調(diào)控，而瘦素組和饑餓激素組之間并沒有差異，更說明了C-FOS作為神經(jīng)元被激活的廣泛性作用。本研究我們的重點聚焦于具有強(qiáng)烈負(fù)能量平衡的Mex3c 在調(diào)節(jié)能量平衡中的作用，已知的C-FOS 蛋白在調(diào)控能量平衡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用而FOS mRNA 作為Mex3c 基因的潛在靶mRNA，所以猜測Mex3c 可能通過調(diào)節(jié)C-FOS 的表達(dá)來參與下丘腦能量平衡的調(diào)控。

Jiao 等[4]發(fā)現(xiàn)，Mex3c-/+小鼠的脂肪減少并且小鼠的能量消耗增加，表現(xiàn)為典型的負(fù)能量代謝狀態(tài)。實驗結(jié)果中我們明顯發(fā)現(xiàn)Mex3c-/+對照組Arc 和VMH 核團(tuán)中C-FOS 呈高表達(dá)，提示不同條件負(fù)能量平衡狀態(tài)下相似的C-FOS 可誘導(dǎo)性；給予Mex3c-/+小鼠瘦素干預(yù)后，并沒有發(fā)現(xiàn)的C-FOS 蛋白上調(diào)，提示瘦素在負(fù)能量代謝機(jī)體中給予較低的C-FOS 可誘導(dǎo)性，再次了證明Mex3c蛋白調(diào)控能量平衡是通過誘導(dǎo)C-FOS 表達(dá)來實現(xiàn)的。本研究數(shù)據(jù)顯示，Mex3c-/+小鼠注射饑餓激素后其Arc 和VMH 核團(tuán)的C-FOS 表達(dá)下調(diào)，在VMH 核團(tuán)中，根據(jù)所得數(shù)據(jù)分析Mex3c-/+饑餓激素組和正常對照組小鼠C-FOS 表達(dá)量無差異，但是目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)論述Mex3c 基因產(chǎn)物和瘦素、饑餓激素參與調(diào)控FOS 表達(dá)的關(guān)系，代表第一信使的激素或是細(xì)胞產(chǎn)物將信號專遞給第二信使，引起靶細(xì)胞的特定反應(yīng)，而C-FOS 作為第三信使調(diào)控靶基因的表達(dá)，改變神經(jīng)元的興奮狀態(tài)從而發(fā)揮作用。我們猜測Mex3c 和瘦素、饑餓激素誘導(dǎo)C-FOS 的表達(dá)有著相同的調(diào)控路徑，在復(fù)雜的信號傳遞中存在一定的協(xié)同或是競爭性抑制作用，使得Mex3c-/+小鼠在給予瘦素和饑餓激素干預(yù)后出現(xiàn)如上結(jié)論，該基因在調(diào)控能量平衡的機(jī)制研究是我們接下來要去完成的。

下丘腦核團(tuán)之間有復(fù)雜而完整的相互聯(lián)系，通過調(diào)節(jié)食物攝入和能量消耗來協(xié)調(diào)能量平衡的維持，研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin 和leptin 等體液因子通常先作用于Arc 核團(tuán)，再通過下丘腦神經(jīng)元之間的互相投射和聯(lián)系參與能量平衡的調(diào)控[20]。Rosas-Vargas 等[21]發(fā)現(xiàn)Mex3c 蛋白在小鼠腦組織中表達(dá)量明顯高于其他部位，尤其是在負(fù)責(zé)調(diào)控能量代謝平衡方面的丘腦和下丘腦，Mex3c 在下丘腦調(diào)節(jié)能量代謝中可能扮演著重要的角色，它和C-FOS 的相互關(guān)系是我們課題組所關(guān)注的焦點。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射瘦素、饑餓激素可以明顯上調(diào)正常小鼠腦核團(tuán)C-FOS 的表達(dá)，而在Mex3c-/+小鼠中，注射饑餓激素后C-FOS表達(dá)量明顯下調(diào)，Mex3c 可通過誘導(dǎo)小鼠下丘腦Arc、VMH 核團(tuán)C-FOS 的表達(dá)進(jìn)而參與神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。