朱砂根種子組織培養(yǎng)與愈傷組織的誘導(dǎo)

侯欣躍　謝鈺鑫　于復(fù)欣　馬宇田　路艷

摘 要：目的：研究藥用觀賞植物朱砂根種子組織快繁技術(shù)和試管苗不同部位愈傷組織誘導(dǎo)，為其轉(zhuǎn)基因、毛狀根誘導(dǎo)、有效藥用成分研究與朱砂根產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)苗木提供依據(jù)。方法：選用當(dāng)年采收，籽粒飽滿，沒有殘缺或畸形，沒有病蟲害的種子為材料，考察不同基本培養(yǎng)基、植物激素對朱砂根種子發(fā)芽誘導(dǎo)、繼代及愈傷組織誘導(dǎo)。結(jié)果：1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L培養(yǎng)基配方比較適用于朱砂根種子初代培養(yǎng);MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培養(yǎng)基配方比較適用于繼代培養(yǎng)。不同外植體中，朱砂根莖段有利于促進(jìn)愈傷組織形成。

關(guān)鍵詞：朱砂根;種子;組織培養(yǎng);愈傷組織

中圖分類號 S567.19文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）13-0025-04

朱砂根（Ardisia crenata Sims），又名大羅傘、富貴籽，是紫金?？疲∕yrsinaceae）紫金牛屬（Ardisia）觀賞藥用植物[1]。在我國，主要零星分布于西藏東南部至臺灣，湖北至海南島等熱帶與亞熱帶地區(qū)[2]。作為傳統(tǒng)藥用植物，朱砂根具有祛風(fēng)除濕、祛痰止咳、降血壓、抗癌抑菌、抗HIV和抗腫瘤等重大功效[3]。朱砂根自然繁殖緩慢，扦插和壓條繁殖系數(shù)相對較低，播種繁殖易產(chǎn)生性狀分離，阻礙了朱砂根的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和利用。植物組織培養(yǎng)在離體條件下獲得再生完整植株，生長周期短，繁殖率高，并能保持優(yōu)良品種的遺傳特性，是拯救瀕危植物、生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值產(chǎn)品、實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的重要技術(shù)方式。黃美娟等[4]報(bào)道了朱砂根莖段組織培養(yǎng)和快速繁殖的培養(yǎng)條件;丁力等[5]研究了不同植物激素對朱砂根愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的影響;陳俊暉等[6]建立了金邊朱砂根的組培快繁體系;蔡長福等[7]探討了朱砂根組織培養(yǎng)防褐化的技術(shù)措施。朱砂根組織培養(yǎng)成苗過程比較漫長，獲取無菌苗的外植體材料一般為帶芽莖段[8-9]，以種子為外植體材料的研究較少。帶芽莖段含真菌、細(xì)菌較多，消毒不徹底極易污染或在組培過程中極易褐化死亡。朱砂根的種子數(shù)量繁多、取材方便、消毒容易、褐化率低，是最理想的外植體材料。本研究以朱砂根當(dāng)年結(jié)實(shí)種子為外植體材料，通過不同的消毒方法、不同濃度細(xì)胞分裂素、生長素的組合使用，開展朱砂根種子離體培養(yǎng)和誘導(dǎo)愈傷組織形成的研究，初步建立朱砂根種子離體快繁技術(shù)和方法，為朱砂根工業(yè)化生產(chǎn)苗木、野生資源保護(hù)與次生代謝化學(xué)成分研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理 實(shí)驗(yàn)在濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。從濰坊廣發(fā)花卉市場購買朱砂根盆栽（帶果實(shí)），采摘當(dāng)年籽粒飽滿、沒有病蟲害的健壯種子。無菌播種前對種子進(jìn)行處理，從植株上摘取朱砂根的成熟果實(shí)，去掉果皮和果肉，在洗衣粉溶液中浸泡30min，搓洗干凈，然后用紗布包住，流水下沖洗5～6h，用無菌水沖洗3遍，置于無菌瓶中用無菌水浸泡24h（每隔12h換水1次）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 消毒時(shí)間試驗(yàn) 將處理好的朱砂根種子置于超凈工作臺上，先用75%酒精消毒20s，無菌水漂洗3～4次;用0.1%HgCl2（升汞）浸泡4min，無菌水漂洗3～4次，再用0.1%HgCl2（升汞）浸泡2、3、4、5、6min，無菌水漂洗5次，無菌濾紙吸干水分后將種子接種到1/2MS培養(yǎng)基上，每瓶接種3粒，共接種10瓶，2次重復(fù)。觀察種子的萌發(fā)情況、褐化情況與污染情況，30d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、褐化率與污染率。

1.2.2 種子無菌接種培養(yǎng)基的篩選 以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，將種子接種到不同激素配方的培養(yǎng)基上（表1）。培養(yǎng)條件：溫度（25±1℃），光照12h/d，光照強(qiáng)度1000lx，光照12h/d。50d后觀察試管苗生長情況。

1.2.3 朱砂根種子試管苗繼代培養(yǎng)基篩選 將生長健壯的種子試管苗剪成1.5～2.0cm長的帶芽莖段，接種到繼代培養(yǎng)基中，注意形態(tài)學(xué)上下端不要顛倒，每瓶接種2～3個(gè)，繼續(xù)培養(yǎng)。以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加不同濃度植物激素組合配方（表2）。觀察莖段和叢生芽生長情況，30d后統(tǒng)計(jì)叢生芽增殖系數(shù)。培養(yǎng)條件：溫度（25±1℃），光照12h·d-1，光照強(qiáng)度2000lx，光照12h/d。

1.2.4 試管苗不同外植體愈傷組織誘導(dǎo) 以MS+6-BA0.2mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D0.5mg/L為基本培養(yǎng)基，接種朱砂根無菌苗的根、莖段和嫩葉，觀察愈傷組織的生長情況，30d后統(tǒng)計(jì)出愈率和愈傷組織增殖系數(shù)。培養(yǎng)條件：溫度（25±1℃），光照12h·d-1，光照強(qiáng)度2000lx，光照12h/d。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Excel2010和SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

啟動率（%）=（發(fā)芽的種子數(shù)/試驗(yàn)種子總數(shù)）×100;褐化率（%）=（褐化的種子數(shù)/試驗(yàn)種子總數(shù)）×100;污染率（%）=（污染的種子數(shù)/試驗(yàn)種子總數(shù)）×100;出愈率（%）=（出現(xiàn)愈傷組織數(shù)/外植體接種數(shù)）×100。叢生芽增殖系數(shù)=（再生叢生芽數(shù)/接種數(shù)）×100;愈傷組織增殖系數(shù)=（30d時(shí)愈傷體積/接種時(shí)愈傷體積）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對種子無菌萌發(fā)的影響 無菌接種后第2d開始觀察不同消毒時(shí)間處理后種子的生長情況。由表3可以看出，滅菌時(shí)間不同，消毒效果不同，污染率不同。種子接種3～7d后，污染的種子周圍培養(yǎng)基開始出現(xiàn)水漬狀菌圈，隨后種子表面長出霉菌。菌圈顏色加深，表現(xiàn)為黃白色、白色、黑色，黑色居多、菌毛較長，形成較大菌圈，培養(yǎng)基表面形成一層墨綠色菌層。在此期間，若發(fā)現(xiàn)接種的種子未全部污染，可將未污染種子及時(shí)轉(zhuǎn)移進(jìn)新培養(yǎng)基中繼續(xù)觀察。種子接種10d后若種子開始長菌污染，主要原因?yàn)榉N子內(nèi)生菌污染或培養(yǎng)過程污染。

消毒時(shí)間6min，種子全部污染。延長消毒時(shí)間到7min，種子發(fā)芽率為36%，污染率最高54%，將時(shí)間延長到8、9min，發(fā)芽率相同污染率接近，將時(shí)間延長至10min，污染率有所下降，種子周圍培養(yǎng)基輕微黃色，并且未發(fā)芽未污染種子所占比重有所增加。結(jié)果表明，滅菌時(shí)間過短消毒不徹底，污染率增加，滅菌時(shí)間過長則產(chǎn)生毒害作用，降低種子活性，種子褐化死亡，影響發(fā)芽。因此選用75%酒精消毒20s，無菌水漂洗3～4次，用0.1%HgCl2消毒總時(shí)長達(dá)到8～9min，朱砂根種子發(fā)芽率為56.7%，污染率36.7%，消毒效果較好。

2.2 不同激素組合對種子發(fā)芽的影響 多數(shù)種子在接種10d后開始萌發(fā)，根點(diǎn)變綠，慢慢突破種皮，伸長成綠色胚根（圖1A）。接種50d后開始長出第1片葉，90d后朱砂根試管苗株高平均4.5cm，生長健壯。不同濃度和配比的激素組合，對朱砂根種子發(fā)芽具有顯著影響。由表4可知，A4培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L發(fā)芽率比較高，發(fā)芽率可達(dá)到77.78%，A2培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.02mg/L種子發(fā)芽率為70.59%以上，A2大部分朱砂根種子發(fā)芽時(shí)間早于A4。NAA濃度相同，相對低濃度的6-BA有利于種子萌發(fā)，6-BA濃度相同，相對高濃度NAA有利于種子萌發(fā)。

2.3 不同激素組合對試管苗繼代培養(yǎng)的影響 朱砂根試管苗莖段接種10d后，莖段頂端保留小葉開始生長，15d后側(cè)芽開始生長，莖段切口產(chǎn)生愈傷組織，30d后側(cè)芽長出新葉（圖1C），60d后長成新的試管苗（圖1D）。不同激素組合對試管苗的繼代培養(yǎng)影響顯著。由表5可見，MS+6-BA1.0mg/L+ NAA0.1mg/L比較適合朱砂根試管苗繼代誘導(dǎo)芽生長，側(cè)芽啟動率為88.42%，明顯高于其他處理。在本研究中，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，繼代苗會在莖段和培養(yǎng)基接觸處出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，影響試管苗的生長發(fā)育。在培養(yǎng)基中加入少量活性炭、及時(shí)更換培養(yǎng)基可以有效抑制褐化現(xiàn)象。

2.4 朱砂根試管苗不同部位愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng) 愈傷組織分化難易程度與植物不同部位有著密切關(guān)系。15～20d后，大部分外植體切口處開始出現(xiàn)愈傷組織（圖1E）。莖段切口出現(xiàn)白色略帶米黃色愈傷組織，愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密;葉片顏色變得鮮綠并開始膨大，未出現(xiàn)愈傷組織，部分葉片邊緣切口發(fā)黑;根部膨大，愈傷組織不明顯，部分根段周圍培養(yǎng)基發(fā)黃。由表6可見，朱砂根的莖段相對于根與葉更適合誘導(dǎo)愈傷組織，褐化少，愈傷組織分裂能力強(qiáng)，長勢好。愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基，10d后愈傷組織不斷膨大生長，由白色略帶黃綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨?，白色愈傷組織結(jié)構(gòu)松散。愈傷組織生長迅速，外層愈傷組織容易褐化，有的分化出小苗（圖1F）。下一次繼代培養(yǎng)時(shí)可以將外層松散愈傷組織切除，繼代培養(yǎng)基中加入少量活性炭，可有效抑制褐化。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論 本次研究結(jié)果可知，無菌播種前，種子用75%酒精消毒20s，0.1%HgCl2（升汞）分2次消毒，消毒總時(shí)長達(dá)8～9min消毒效果最好。細(xì)胞分裂素與生長素不同濃度配比影響朱砂根種子萌發(fā)和芽苗的繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L適合于朱砂根種子無菌播種培養(yǎng)，種子發(fā)芽率可達(dá)到77.78%;培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L適合于種子試管苗繼代培養(yǎng)，誘導(dǎo)率為88.42%。在朱砂根組織培養(yǎng)過程中，及時(shí)更換培養(yǎng)基，加入少量活性炭可有效抑制組織褐化。不同外植體中，朱砂根莖段比較適合促進(jìn)愈傷組織形成，誘導(dǎo)率為83.33%，同時(shí)愈傷組織生長狀況良好。

3.2 討論

3.2.1 消毒方法 外植體的無菌消毒是植物離體培養(yǎng)技術(shù)成功的關(guān)鍵。植物材料不同，采用的消毒劑的種類和濃度不同。胡海英等[10]對金蓮花種子采用無毒級殺菌消毒劑愛力克與75%乙醇配合消毒， 消毒效果最佳;蔡長福等[7]從消毒液的種類和濃度等方面，探討了朱砂根外植體消毒的有效方法。本研究對原有的朱砂根種子消毒處理方法進(jìn)行改進(jìn)，有效提高了消毒效果。增加流水沖洗時(shí)間至5～6h，置于無菌瓶中用無菌水浸泡24h，增加75%酒精消毒時(shí)間至20s，能夠消滅大部分的細(xì)菌，同時(shí)不影響種子的活性。HgCl2作消毒劑，種子消毒過程中消毒時(shí)間過久會出現(xiàn)毒害現(xiàn)象，影響種子萌發(fā)[11]。本研究將升汞消毒時(shí)間分成2段，減緩了升汞對種子的毒害作用，起到很好的消毒效果。除此之外，本研究采用增加升汞濃度、升汞與吐溫配用等消毒措施，均沒有取得良好效果。朱砂根外植體污染率高，與朱砂根生長環(huán)境避光陰濕、微生物活性強(qiáng)，果實(shí)堅(jiān)硬、種子含有內(nèi)生菌等因素有關(guān)，增加了消毒難度。

3.2.2 植物激素 朱砂根種子無菌培養(yǎng)過程中，植物激素起到重要作用。植物不同生長時(shí)期，所需的激素種類和濃度不同。本研究主要探討了6-BA，NAA 2種植物激素對朱砂根種子與叢生芽誘導(dǎo)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，種子萌發(fā)時(shí)期NAA生長素需要量低于幼苗時(shí)期。在種子離體培養(yǎng)過程中7d內(nèi)需要重點(diǎn)觀察，若出現(xiàn)污染及時(shí)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基補(bǔ)救可以有效降低污染率。關(guān)于朱砂根無根苗接種到培養(yǎng)基中，切段不帶頂芽葉腋中的小芽生長較快，帶頂芽生長緩慢，研究結(jié)果與馬明東等[8]的結(jié)果相似。7d繼代培養(yǎng)，幼苗生長緩慢，腋芽數(shù)量少，隨著繼代次數(shù)增加，單株試管苗腋芽數(shù)量也開始增多，可逐漸達(dá)成擴(kuò)繁效果。

3.2.3 愈傷組織因素 組織培養(yǎng)過程中，植物細(xì)胞損傷、無菌環(huán)境等條件會促進(jìn)愈傷組織形成。愈傷組織是由植物細(xì)胞分化的薄壁細(xì)胞，可進(jìn)行脫分化形成新植株。朱砂根組織培養(yǎng)中形成的愈傷組織大多呈現(xiàn)黃白色。在促進(jìn)朱砂根形成愈傷組織過程中，朱砂根不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)其莖段產(chǎn)生愈傷組織產(chǎn)量高于葉與根，與黃素華等[12]的研究結(jié)果相似。葉片和根段愈傷組織分化能力弱，切口受創(chuàng)相對面積大，傷口處分泌的酚類化合物被氧化為醌，醌通過非酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)而導(dǎo)致組織褐變，易向培養(yǎng)基內(nèi)釋放褐化物質(zhì)，使培養(yǎng)基變黃。導(dǎo)致細(xì)胞失去愈傷組織分化能力，褐化死亡。莖段分裂能力最強(qiáng)，褐化少分化愈傷組織時(shí)間短，適用于誘導(dǎo)愈傷組織[13]。

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