基于UPLC-QTOF-MS識別牛乳與羊乳差異

房艷 ，于思雨，高俊海 ，宋薇*，宋敬寧

1. 譜尼測試集團股份有限公司（北京 100095）；2. 譜尼測試集團北京科學技術研究院有限公司（北京 100095）

羊乳富含蛋白質、脂肪和礦物質，被公認為營養(yǎng)組成最接近母乳的乳品。因其含有的脂肪球和乳糖的顆粒小，極其適于乳糖不耐受癥人群的飲用。羊乳及羊乳制品受到消費者青睞和關注，國內外需求市場不斷升溫。然而，羊乳產量過低，難以滿足日益增長的消費需求，在暴利驅使下時常發(fā)生以牛乳或摻雜牛乳的羊乳冒充純羊乳的惡劣情況。因此，建立一種有效識別純羊乳、牛乳和摻雜牛乳的羊乳的分析方法，對于監(jiān)管規(guī)范市場和保障消費者權益具有重要意義。

研究多以蛋白質、脂肪等大分子化學物質的差異來識別牛乳和羊乳，主要利用色譜法、電泳法、免疫化學法、氣相色譜法等。Chen等[1]以β-乳球蛋白為標志物，識別羊乳中是否摻雜牛乳；Mayer等[2]利用高效液相色譜法比較脂肪酸組成以區(qū)分摻入牛乳的羊乳；Hanane等[3]通過氣相色譜法分析甘油三酯組成檢測羊乳中是否摻入牛乳；石燕等[4]采用毛細管電泳法分離牛乳和羊乳蛋白并以酪蛋白進行定性定量。質譜、非線性化學指紋圖譜、電子鼻等新興技術為牛乳和羊乳的鑒別提供更為多樣且可靠的技術手段。樊成等[5]基于非線性化學指紋圖譜法確定牛羊混合二元乳中2種乳的含量比例；魯利利等[6]通過非線性電化學指紋圖譜的直觀特征和系統相似度模式鑒別不同產地的牛羊乳；馬利杰等[7]利用電子鼻對羊乳粉中摻入牛乳粉進行檢測。然而，乳品中含有種類繁多的氨基酸類、糖類、維生素及天然代謝產物等小分子化學物質，且其組成和種類受乳品來源影響較大，但受限于物質的含量較少、物質復雜、結構相似等因素，鮮有以小分子化學物質（分子量MW＜500 amu）來識別牛乳和羊乳差異的研究。因超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜（UPLC-QTOF-MS）技術對于除大分子蛋白質外的寬質量數范圍的低揮發(fā)性物質具有較高的靈敏度和分辨率，可實現物質的高效分離以及母離子、碎片離子的精確質量數測定，且對復雜基質中物質的分析鑒定具有一定優(yōu)勢；此外，代謝組學是一種高通量分析技術，以組群指標分析為基礎，可對代謝成分進行全面、整體和無差別的分析，兩種技術相結合可實現海量有效數據的采集、篩選、比對，被廣泛應用于乳制品、醫(yī)藥、茶葉、水產品等領域的化學成分比較分析、主成分鑒定和代謝研究[8-15]。因此，試驗利用UPLC-QTOF-MS分析羊乳和牛乳在小分子化學物質層面上的差異，篩選并確定潛在生物標志物，并對比甲醇和乙腈作為蛋白沉淀劑的差異，進一步建立一種高精確度的牛乳與羊乳的鑒定識別技術。

1 材料與方法

1.1 樣品、儀器與試劑

羊乳Ⅰ（G1，源自內蒙某牧場）；羊乳Ⅱ（G2，源自內蒙某牧場）；羊乳粉Ⅰ（G3，源自內蒙某企業(yè)）；羊乳Ⅲ（G4，市售）；羊乳Ⅳ（G5，市售）；羊乳Ⅴ（G6，市售）；羊乳粉Ⅱ（G7，市售）；羊乳粉Ⅲ（G8，市售）；牛乳Ⅰ～Ⅶ（C1～C7，市售）；牛乳粉（C8，市售）；牛乳Ⅷ～Ⅸ（C9～C10，市售）；甲醇（質譜級，美國Honeywell Inernational公司）；乙腈（質譜級，美國Honeywell Inernational公司）；甲酸（分析純，西隴科學股份有限公司）；亮氨酸腦啡肽（分析純，CAS 58822-25-6，美國Waters公司）；除UPLC-Q-TOF系統用水之外的水皆為超純水，經Millipore-Q超純水凈化儀制備；濾膜（尼龍，0.2 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）。

超高效液相-四極桿-飛行時間質譜儀（Waters Xevo G2-XS QTof/UPLC系統，配有PDA檢測器，美國Waters公司）；Mass Lynx軟件（v 4.1，美國Waters公司）；UNIFI軟件（v 1.9.4，美國Waters公司）；UNIFI 1.8軟件系統（美國Waters公司）；EZinfo軟件（美國Waters公司）；Millipore-Q超純水凈化儀（美國Millipore-Q公司）；Vortex-Genie 2渦旋震蕩器（美國Scientific Industries公司）；H1850臺式高速離心機（湖南湘義離心機儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 預處理

乳粉：稱取1 g（精確至0.01 g）試樣于離心管中，加入4 mL水溶解，渦旋混勻；加入12 mL蛋白沉淀劑，以4 000 r/min離心15 min，取上清液過膜，供測試。乳液：量取4 mL試樣于離心管中，加入12 mL蛋白沉淀劑，以4 000 r/min離心15 min，取上清液過膜，供測試。分別以甲醇和乙腈為蛋白沉淀劑進行樣品處理。

1.2.2 儀器條件

1.2.2.1 UPLC條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL；流動相，0.1%甲酸乙腈（A），0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫，0～0.5 min，2% A；0.5～6 min，2%～20% A；6～7 min，20%～30% A；7～9 min，30%～70% A；9～10 min 70%～98% A；10～12 min，98%A；12～14 min，98%～2% A；14～16 min，2% A。

1.2.2.2 Q-TOF條件

電噴霧離子源（ESI），正離子和負離子模式，MSE模式采集；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度300℃；脫溶劑氣流速600 L/h；錐孔氣流速20 L/h；毛細管電壓3.0 kV/2.5 kV；錐孔電壓40 V；掃描模式，靈敏度模式；掃描范圍m/z100～1 200；掃描時間0.2 s；碰撞能量，低碰撞能量為off，高碰撞能量10～50 eV；實時校正液，亮氨酸腦啡肽（正離子條件m/z556.277 1，負離子條件m/z554.261 5）。

1.2.3 數據處理

采集羊乳（G組）、牛乳（C組）和混合質控（QC）的MSE數據，經UNIFI軟件完成質量校正、加和離子設定、去噪等處理，導入EZinfo軟件進行無監(jiān)督分析的主成分分析（PCA）與有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別式分析（OPLS-DA），在VIP值≥1（化合物對分組的貢獻程度值，VIP）的物質中進行篩選，并結合公共平臺資源進行潛在生物標志物的鑒定。

2 結果與討論

2.1 以甲醇為沉淀劑的代謝組學分析

2.1.1 TIC和BPI分析

以甲醇為蛋白沉淀劑制備的樣液經UPLC-QTOFMS分析，對比羊乳（G7和G8）與牛乳（C9和C10）樣品在正離子模式下的總離子流色譜圖（TIC），無明顯差異，見圖1。

為預先從譜圖直觀獲得有效信息，將TIC以每一時刻點信號最強的離子碎片（BPI）重繪，如圖2所示。G7、G8和C9、C10這2組樣品的BPI圖存在較明顯差異，在保留時間（RT）2.27，6.56和8.90 min處，C9和C10能觀察到G7和G8中沒有的明顯譜峰。經UNIFI分析高碰撞能和低碰撞能譜圖，RT 2.27 min為單電荷低分子量物質，RT 6.56 min和8.90 min均為多電荷蛋白或多肽。試驗旨在分析羊乳和牛乳在小分子化學物質層面上差異，因此以RT 2.27 min且m/z254.159 7的小分子差異性物質為標志物進一步分析。但EZinfo數據處理結果顯示，該物質在牛乳中含量較高，在羊乳中也存在但含量較低，并非最為理想的標志物。

2.1.2 多元統計分析

因從譜圖著手的直觀分析非常有限，為了評價2組樣品間差異，進一步從數據著手進行PCA和OPLSDA多元統計分析，見圖3和圖4。每個樣品平行測定3次且穩(wěn)定性良好，過程中以混合質控樣品監(jiān)控設備穩(wěn)定性。如圖3所示，G組樣品全部分布于左側區(qū)域，C組樣品幾乎全部分布于右側區(qū)域，說明牛乳和羊乳樣品在此條件下存在顯著差異。PCA分析雖能通過原始數據直觀反映兩組樣品間的整體差異，但無法消除隨機誤差和組內誤差，為了更準確地尋求差異，借由OPLS-DA進一步驗證。

進一步對比分析，得到S-plot圖。VIP值越大，在S-plot圖中的分布越靠近兩極，代表化合物對兩組樣品分組的貢獻程度越大。如圖4所示，明顯觀察到C組對分組貢獻度高的化合物比G組多，與BPI分析的差異性物質均來自于C組的結果相一致。以VIP值≥1為篩選條件，初步得到2 394個物質信息，進一步以該物質只存在于G組或C組中為原則，僅初步篩選出一種RT 1.64 min、m/z137.043 5且只存在于G組的小分子化學物質，且在高碰撞能通道出現m/z119.032 8，m/z110.033 3和m/z135.024 1等碎片信息。

以常見元素C、H、O、N、P、S、Cl、Br為組成元素，推測其化學式可能為C4H8O5、C5H4N4O、C5H12S2、C3H9N2O2P；借助HMDB和Chemspider等公眾平臺資源，結合高碰撞能通道子離子信息、光譜信息和物質信息等，推測C5H4N4O為該物質的可能性最高。該分子式對應的化合物包括次黃嘌呤和別嘌醇等，結合已刊發(fā)的文獻資料，推測該物質可能為次黃嘌呤；次黃嘌呤是核苷的代謝產物，是一種重要的生物堿嘌呤，對平喘、舒張支氣管和降壓具有一定作用。曾在羊水、母乳、血液、尿液中[16-24]檢出。

從TIC和BPI未能直觀獲得有效物質信息，根據化合物對分組的貢獻程度值，得到1種只存在于G組羊乳樣品中的小分子化合物，其RT 1.64 min、m/z137.043 5、VIP 1.122 83，可作為一種識別牛乳和羊乳差異的小分子潛在生物標志物。該物質可能為次黃嘌呤，有待進一步確證。

圖2 以甲醇為沉淀劑時G7、G8與C9、C10的BPI圖

圖3 以甲醇為沉淀劑時的PCA圖

圖4 以甲醇為沉淀劑時的OPLS-DA得分圖（S-plot）

2.2 以乙腈為沉淀劑的代謝組學分析

2.2.1 TIC和BPI分析

由此可見，以甲醇為蛋白沉淀劑時仍有部分多肽或蛋白質殘留在樣液中并被檢測到，更換乙腈為蛋白沉淀劑，分析結果如圖5所示。G1～G8與C1～C8正離子模式下的TIC仍無明顯差異，BPI重繪時G組和C組的組內樣品譜圖差異性較小，因此以G1和C6為典型示例進行分析，見圖6。

圖5 以乙腈為沉淀劑時G1～G8與C1～C8的TIC圖

圖6 以乙腈為沉淀劑時G1與C6的BPI圖

在保留時間（RT）4.57 min處，G1能觀察到C6中沒有的明顯譜峰，經UNIFI分析高碰撞能和低碰撞能譜圖，該物質為小分子物質且m/z246.169 7，但C組和G組中均存在該物質，僅體現為C組含量穩(wěn)定且明顯低于G組，雖非理想的標志物，但可以作為特征物質輔助鑒定牛乳與羊乳。以常見元素C、H、O、N、P、S、Cl、Br為組成元素，推測其化學式最可能為C12H23NO4；借助HMDB和Chemspider等公眾平臺資源，結合高碰撞能通道子離子信息、光譜信息和物質信息等，推測C12H23NO4為該物質的可能性最高。分子式對應的化合物包括2-甲基丁?？嵬　?-甲基丁?？嵬『褪逦祯；鈮A等，結合已刊發(fā)的文獻資料，推測該物質可能為2-甲基丁?？嵬。撐镔|在小鼠的血清、人類尿液中可檢出[25-27]。同時，未檢測到多電荷蛋白或多肽差異化合物，說明乙腈對于牛乳和羊乳的沉淀效果較佳。

2.2.2 多元統計分析

如圖7所示，G4、G5、G6與C組處于相同分區(qū)，且該3種羊乳樣品為市售產品，推測可能為加工工藝不同或有牛乳原料引入。其他G組和C組樣品分別分布于左右兩側，與甲醇為沉淀劑時的結果一致。排除G4、G5、G6繪制S-plot圖，見圖8。C組對分組貢獻度高的化合物比G組多，與甲醇為沉淀劑時的結果相同。

圖7 以乙腈為沉淀劑時的PCA圖

圖8 以乙腈為沉淀劑時的OPLS-DA得分圖（S-plot）

以VIP值≥1為篩選條件，初步得到1 597個物質信息，以該物質只存在于G組或C組為原則，僅初步篩選一種RT 6.65 min、m/z491.285 5且只存在于C組的小分子化學物質，推測其分子式可能為C25H38N4O6、C24H42O10。因分子量較大，可能的化合物達數千種且無明顯碎片信息輔助推斷，因此無可疑化合物。但以此標志物可有效識別羊乳中的牛乳摻假情況。

同時，與甲醇為沉淀劑的結果比對，乙腈處理的樣品中也存在m/z254.161 0和m/z137.043 5的物質。結果顯示，m/z254.161 0的物質在C組樣品中均檢出，且C2、C3、C4、C5的含量相對較高，G組中則僅新鮮羊乳G1、G2中未檢出，說明該物質較為適用于新鮮羊乳的識別；m/z137.043 5的物質在C組樣品中均未檢出，G組僅羊乳粉G8未檢出，說明該物質較為符合識別牛乳和羊乳的潛在生物標志物的要求。乙腈為沉淀劑時確定的m/z491.285 5的物質未在以甲醇為沉淀劑時出現。

此外，采用相同方式對負離子模式采集數據進行分析。雖然在PCA模型中牛乳與羊乳實現分離，但差異物質較少，因此負離子模式未在此次研究中進行詳細討論。

3 結論

基于UPLC-QTOF-MS，以小分子化學物質為研究對象，建立一種識別牛乳和羊乳的檢測方法。分別以甲醇、乙腈為蛋白質沉淀劑處理試樣，分析正離子模式下的TIC、BPI譜圖，建立主成分分析（PCA）模式，用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）找出差異代謝產物，以僅存在于牛乳或羊乳為原則，識別出次黃嘌呤和一種m/z491.285 5但未進一步鑒定的化合物，另識別出一種在羊乳中含量高，可作為特征物質輔助鑒定牛乳與羊乳物質，2-甲基丁?？嵬?，并借由主成分分析和正交偏最小二乘法-判別式分析等方式，甲醇、乙腈作沉淀劑的結果相互印證。該方法簡單、便捷，且靈敏度較高，為羊乳和牛乳的識別提供參考，為乳制品市場的進一步規(guī)范提供技術支撐。