尼羅羅非魚干擾素調(diào)節(jié)因子4基因的克隆與表達

羅國玲，馬嘉霖，莫芳玲，陳俊羲，羅偉濤，楊 琴，黃 瑜

尼羅羅非魚干擾素調(diào)節(jié)因子4基因的克隆與表達

羅國玲1,2,3，馬嘉霖1，莫芳玲1，陳俊羲1，羅偉濤1，楊 琴1，黃 瑜1,2,3

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室 // 3. 水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制廣東省普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【】探究干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）在尼羅羅非魚（）免疫中的作用。從尼羅羅非魚中鑒定IRF4同源物，命名為。使用生物信息學(xué)分析軟件分析的氨基酸序列。對健康尼羅羅非魚腹腔注射濃度為3×107CFU/mL的無乳鏈球菌200 μL，用實時熒光定量PCR法分析在健康魚中的表達模式及其對細菌感染的生物學(xué)效應(yīng)?！尽啃蛄械拈_放閱讀框為1 350 bp，編碼449個氨基酸。OnIRF4與其他物種的IRF4蛋白的同源性為52% ~ 98%。推導(dǎo)的肽鏈具有干擾素因子典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）、干擾素相聯(lián)結(jié)構(gòu)域（IAD）。亞細胞定位結(jié)果表明，主要定位在細胞核。表達分析表明，在健康尼羅羅非魚皮膚、頭腎、鰓、腦、腸、肌肉、肝、胸腺和脾中均有分布。在無乳鏈球菌（）感染后，在肝臟、脾臟、頭腎、腦中的表達顯著上調(diào)（< 0.05），表明參與了尼羅羅非魚對細菌感染的免疫反應(yīng)。

尼羅羅非魚；干擾素調(diào)節(jié)因子4；基因表達；無乳鏈球菌

尼羅羅非魚() 為我國重要的經(jīng)濟魚類。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，高密度養(yǎng)殖以及水體污染原因?qū)е虏『︻l發(fā)，經(jīng)濟損失巨大[1]。研究尼羅羅非魚免疫機制可為其病害防治提供基礎(chǔ)。

干擾素（Interferon，IFN）是一種多功能細胞因子，在抗病毒反應(yīng)，免疫調(diào)節(jié)，細胞生長、分化、凋亡方面發(fā)揮重要的作用[2]，其分泌受干擾素調(diào)節(jié)因子（Interferon regulatory factors，IRFs）調(diào)節(jié)。IRF家族可分為IRF1、IRF3、IRF4和IRF5等4個亞家族（IRF4、IRF8、IRF9、IRF10基因隸屬于IRF4亞家族[3-4]）。IRF4（亦稱Pip、LISIRF、LCSAT、MUM1）有助于樹突狀細胞的發(fā)育[5]，參與先天免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)[6]。其通過調(diào)節(jié)與輔助性T細胞17（Helper T cells 17，Th17）分化相關(guān)的3個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、RORa和RORgt的表達模式，在白細胞介素21（IL-21）介導(dǎo)的Th17發(fā)育過程中有重要作用。IRF4在哺乳動物中研究較多，最近發(fā)現(xiàn)IRF4也存在于虹鱒（）、黃鱔（）和巖鯛（）中[8-10]。虹鱒在受病原刺激后其肝臟和脾臟中表達顯著上調(diào)，IRF可能在淋巴組織吞噬細胞吞噬、清除病原菌過程發(fā)揮重要作用；而受病毒和細菌感染的巖鯛腎臟和脾臟中大量表達，表明不僅對病毒和細菌病原入侵有保護作用，而且可能是硬骨魚類的免疫調(diào)節(jié)因子。研究IRFs的調(diào)控機制對研究尼羅羅非魚機體免疫機制及其疾病防治有重要作用[11]。筆者克隆尼羅羅非魚IRF4基因（）的開放閱讀框片段，構(gòu)建亞細胞定位表達載體，以研究其在細胞中的定位，并用qRT-PCR法研究在健康個體組織分布情況，以及無乳鏈球菌刺激后的表達模式，為進一步探究參與的機體免疫反應(yīng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用尼羅羅非魚取自于廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地，體質(zhì)量（50±10）g?？寺≥d體pMD18-T、rTaq聚合酶、Extaq聚合酶，TaKaRa公司(日本)；柱式RNA提取試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）、實時熒光定量試劑盒（TransStart Green qPCR SuperMix）以及DH5α感受態(tài)細胞，北京全式金生物技術(shù)有限公司；Thermo Scientific GeneJET凝膠回收試劑盒、核酸marker，Thermo Fisher公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。無乳鏈球菌（）及FHM細胞（胖頭鯉肌肉細胞系）由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 病原刺激 尼羅羅非魚于水箱中暫養(yǎng)1周，隨機選取5尾，對其肝臟、脾臟及頭腎等組織進行病原微生物檢測，確定尼羅羅非魚處于健康狀態(tài)。于無菌環(huán)境下取健康魚皮膚、頭腎、鰓、腦、腸、肌肉、肝、胸腺和脾于2 mL凍存管，置液氮速凍后于–80 ℃冰箱保存，用于基因克隆和后續(xù)使用。

無乳鏈球菌于37℃培養(yǎng)6 h后，取菌液離心，用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋至終濃度為1×107CFU/mL。參考文獻[12]，對尼羅羅非魚腹腔注射100 μL的無乳鏈球菌，在注射后0、6、12、24、48、72、96 h各取尼羅羅非魚3尾，收集其脾臟、頭腎、鰓和腦，液氮冷凍后于- 80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取及第一cDNA鏈合成 樣品用TransZol up裂解（每mL 50 mg），按照RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將各樣本的組織RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈 cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 500 ng, Anchored Oligo(dT)18 引物(0.5 μg /μL) 1 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL, TransScript? RT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover 1 μL，補無RNA酶水至20 μL。將混合物在45 ℃下反應(yīng)30 min后，于85 ℃下孵育5 min至酶失活。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于– 20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3開放閱讀框克隆及測序 根據(jù)NCBI上公布的基因序列(GeneBank登錄號：XP_005476429.1)，利用Primer 5.0 設(shè)計一對開放閱讀框（Open Reading Frame, ORF）擴增引物（IRF4-ORF-F/R）（表1）。以脾臟的第一鏈cDNA為模板，通過PCR擴增IRF4的ORF片段，反應(yīng)體系：Ex Taq 10 μL，ddH2O 7 μL，cDNA 模板1 μL，IRF4-ORF-F/R 1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，16 ℃下保存擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測達標后，進行切膠回收及PCR產(chǎn)物純化。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體相連接，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐的LB瓊脂培養(yǎng)基，倒置于37 ℃下培養(yǎng)12 h。挑取單菌落，用pMD18-T載體的通用引物M13-R/F進行菌落PCR檢測，陽性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 引物

1.2.4基因生物信息學(xué)分析 將NCBI預(yù)測的全長序列及測序結(jié)果用DNAMAN進行片段連接和序列比對，運用ORF-finder在線程序?qū)ふ覞撛诘腛RF區(qū)，用ExPASy ProtParam tool和DNAMAN推導(dǎo)的相關(guān)氨基酸序列并分析相關(guān)理化性質(zhì)。根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列，通過SMART（http://smart.embl-hei delberg.de/）搜索結(jié)構(gòu)域。使用swiss模型預(yù)測算法（http://SWISSMODEL. expasy.org/）建立潛在的三維結(jié)構(gòu)，并由Deepview/ SWISS Pdb Viewer version 4.0顯示。用PSORT Prediction預(yù)測的亞細胞定位。用ClustalW多重比對程序（http://www.ebi.ac.uk/ ClustalW/）創(chuàng)建多重序列比對。采用MEGA 6.0的鄰接法進行系統(tǒng)進化樹分析，Bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.2.5亞細胞定位 設(shè)計一對亞細胞定位表達引物IRF4-XHol-F、IRF4-EcoRI-R，以脾臟第一鏈cDNA為模板克隆目的片段，反應(yīng)程序同1.2.3。用Ⅰ和Ⅰ限制性快切酶對PCR產(chǎn)物及亞細胞定位表達質(zhì)粒PGEFP-N1進行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后，將目的基因片段與PGEFP-N1空質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于LB瓊脂糖固體平板上，挑取單菌落，經(jīng)菌落PCR鑒定后挑選陽性樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

將無菌蓋玻片放入24孔細胞板，每孔接種500 μL FHM細胞。FHM細胞在含體積分數(shù)15%胎牛血清的L-15細胞培養(yǎng)基、28 ℃條件下培養(yǎng)至80%細胞貼壁后，對測序正確的菌株進行去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取及濃度測定，按照Lip3000試劑使用說明書，將空的PGEFP-N1質(zhì)?；虺晒?gòu)建的IRF4-PGEFP-N1轉(zhuǎn)染至FHM細胞內(nèi)。24 h后吸出玻片邊緣的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞，加入150 μL體積分數(shù)4%多聚甲醛固定液，靜置30 min。吸去多聚甲醛固定液，用PBS再次洗滌，加入100 μL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) 進行細胞核染色。染色10 min后，用水溶性封片劑封片，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.2.6基因的表達分析 設(shè)計一對熒光定量引物qIRF4-F/R，用β-actin作為內(nèi)參基因。對健康尼羅羅非魚的組織樣品及病原刺激后的組織樣品進行RNA提取及cDNA合成，方法同1.2.2。利用LightCycler?96實時熒光定量PCR儀進行基因的表達分析。實驗參照TransStart? Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進行，反應(yīng)體系如下：qPCR SuperMix 5 μL，cDNA 0.5 μL，dH2O 3.5 μL，上下游引物0.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s [溶解曲線分析（Dissociation Stage）]。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，利用2-ΔΔCt方法計算相對表達量。使用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 OnIRF4開放閱讀框擴增及序列的表征

克隆的基因片段長度約1 350 bp，與pMD-18T連接后，測序，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，其與的ORF區(qū)100％重合。ORF片段長度為1 350 bp，編碼449個氨基酸（圖1）。cDNA有141 bp的5′UTR和1 952 bp的3′UTR，3′UTR中有1個poly（A）加尾信號（AATAAA）。理論分子質(zhì)量為51.783 ku，等電點為6.21。該蛋白平均親水值（GRAVY）為-0.817，屬親水性蛋白。SMART分析可知，IRF4氨基酸序列含有１個N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（N-terminal DNA binding region，DAB）和１個C端干擾素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(C-terminal interferon related region，IAD)（圖2）。經(jīng)預(yù)測可知，IRF4主要分布于細胞核；有N-糖基化位點4個、蛋白激酶C磷酸化位點10個、酪蛋白激酶II磷酸化位點12個、N-肉豆蔻?；稽c6個、異戊二烯基結(jié)合位點（CAAX框）3個、微抗體C端靶向信號10個。

方框部分是起始密碼子和終止密碼子；陰影部分為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；單下劃線為IRF相關(guān)結(jié)構(gòu)域；雙下劃線為poly(A) 加尾信號

圖2 尼羅羅非魚OnIRF4基因結(jié)構(gòu)域

2.2 OnIRF4蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖3可見，OnIRF4蛋白449個氨基酸殘基中，包含23.16%的α螺旋（藍色h）、12.25%的延伸鏈（紅色e）、4.68%的β轉(zhuǎn)角（綠色t）及59.91%的無規(guī)則卷曲（黃色c），其中，無規(guī)則卷曲是最多的結(jié)構(gòu)元件。通過構(gòu)建的蛋白三維立體結(jié)構(gòu)模型（圖4）發(fā)現(xiàn)，該蛋白與人類的同源物有一定同源性。

圖3 OnIRF4蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖4 尼羅羅非魚IRF4蛋白與人類的三維結(jié)構(gòu)

2.3 OnIRF4多重序列比對分析

圖5表明，OnIRF4氨基酸序列與其他物種IRF4的相似性為98.00% ~ 52.12%。與鱸形目慈鯛科的淡水魚類美妊麗魚（）同源性最高，為98％，與鰓魚科黃鱔屬動物同源性較低，為64.46%。此外，所比對序列均有IRF的DAB和IAD保守結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，且保守結(jié)構(gòu)域的同源性高。

虛下劃線，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；實線下劃線，IRF相關(guān)結(jié)構(gòu)域；GenBank登錄號：尼羅羅非魚，XP_005476429.1；美妊麗魚，XP_026005407.1; 斑馬擬麗魚，XP_004542815.1; 原雞，NP_989630.1; 牛，NP_001193091.1; 人，AAH15752.1; 小鼠，AAI37714.1; 黃鱔，AFQ22942.1

2.4 系統(tǒng)進化分析

圖6可見，與斑馬擬麗魚（）基因聚為一支，親緣關(guān)系較近，與庫舍劍尾魚（）聚為一類。哺乳動物聚為一簇，魚類聚為一簇。

2.5 OnIRF4的亞細胞定位

圖7可見，在尼羅羅非魚PGEFP-N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞中，綠色熒光均勻分布于整個細胞。而在OnIRF4-PGEFP-N1融合蛋白轉(zhuǎn)染的細胞中，綠色熒光蛋白主要分布于細胞核，與PSORT Prediction預(yù)測的結(jié)果相符；在細胞質(zhì)中也有少量分布，推測細胞質(zhì)中的綠色熒光蛋白在核糖體中合成，未能及時轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)。

圖6 尼羅羅非魚與其他物種IRF4的系統(tǒng)進化樹分析

圖7 OnIRF4在FHM細胞中的亞細胞定位

2.6 IRF4在尼羅尼羅羅非魚不同組織中的表達

圖8顯示，在腦、肝臟、腸道、頭腎、肌肉、脾、皮膚、鰓和胸腺等9個組織中均有表達，但相對表達量差異較大。在腦中表達量最高，肝臟、腸道和頭腎中的表達水平較高，在肌肉、脾、皮膚、鰓相對表達量較低，在胸腺中表達量最低。

2.7 OnIRF4在感染無乳鏈球菌后的表達模式

圖9顯示，在感染無乳鏈球菌后，尼羅羅非魚的mRNA表達水平在3個免疫相關(guān)組織中均顯著上調(diào)（< 0.05）。頭腎于感染后6、12 h相對表達量明顯上調(diào)（圖9A），鰓于感染后6、24 h相對表達量顯著上調(diào) (圖9B)，脾臟于感染后6、48、72、96 h相對表達量明顯上調(diào) (圖9C)。腦于感染后12、48 h表達量明顯上調(diào)（圖9D）

TH，胸腺；GI，鰓；SK，皮膚；SP，脾；M，肌肉；HK，頭腎；IN，腸；LI，肝；BR，腦

*，與0 h對照組有顯著性差異（P < 0.05）

3 討論

本研究從尼羅羅非魚脾臟中克隆得基因ORF片段，根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列，ORF片段包含1 350 bp，可編碼449個氨基酸；理論分子質(zhì)量為51.783 ku，理論等電點為6.21；含有IRF4家族的典型結(jié)構(gòu)域，即１個N端的DAB和１個C端的IAD，魚類IRF4的DAB、IAD序列與哺乳動物的同源性較高，表明IRF4的作用方式在進化上較為保守。此外預(yù)測在DBD內(nèi)含有色氨酸五重肽重復(fù)區(qū)，這是針對病毒誘導(dǎo)的磷酸化，以促進與其他IRF家族成員的相互作用和隨后激活病毒清除信號通路的結(jié)構(gòu)域，表明IRF4可能在尼羅羅非魚中作為免疫應(yīng)答的干擾素發(fā)揮作用。系統(tǒng)進化樹反映的進化關(guān)系與傳統(tǒng)分類地位基本一致。

OnIRF4的亞細胞定位結(jié)果與斑馬魚IRF4a[13]相似，主要在細胞核內(nèi)表達。尼羅羅非魚IRF4在沒有刺激的情況下主要分布在細胞核中，表明IRF4主要在細胞核中發(fā)揮調(diào)控細胞凋亡與生長及免疫應(yīng)答等作用。

可在巨噬細胞中表達，且在B細胞、T細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞的發(fā)育和分化中發(fā)揮重要的作用[14-17]，腦中含有大量的巨噬細胞[18]，本研究中，在腦中表達量最高，暗示著參與了魚腦部巨噬細胞的發(fā)育和分化。在其他硬骨魚類中，也在富含淋巴細胞的器官或黏膜免疫組織（肝臟、腸道、頭腎和脾臟）中大量表達，如在黃鱔[8]的腸、頭腎中表達量較高，在褐牙鲆（）[19]的脾臟、頭腎、鰓中表達量較高，在虹鱒[10]的脾臟、腎臟和鰓組織中表達量較高，表明在先天性和適應(yīng)性免疫中起重要作用。然而，在健康尼羅羅非魚鰓中IRF4的表達量相對于同為微生物感染入口的腸道低，推測OnIRF4主要參與抵御腸道微生物入侵。此外，在肌肉中也有相對較高的表達水平，表明在非免疫組織中亦有潛在的作用。

在免疫應(yīng)答中發(fā)揮一定作用[9]。鰓是魚類黏膜免疫系統(tǒng)的第一道屏障[20]，極易受病原感染；頭腎和脾臟是硬骨魚類的主要免疫器官[21]，而魚的腦中含有大量的吞噬細胞[18]。本研究中，在無乳鏈球菌感染后基因表達在頭腎、脾臟、鰓和腦均在6 h內(nèi)表達顯著上調(diào)，提示尼羅羅非魚的參與黏膜免疫，并在免疫相關(guān)組織感染后可快速響應(yīng)[22]，提示在抗菌反應(yīng)中起重要作用。在頭腎中觀察到最大的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(72.9倍，< 0.01)，頭腎為硬骨魚類重要的內(nèi)分泌和造血器官[23]，在頭腎中最大響應(yīng)進一步表明其在免疫應(yīng)答中的重要作用。此外，在無乳鏈球菌注射后的48、72、96 h后，脾臟的表達量再次顯著上調(diào)，可能是由于組織中的巨噬細胞聚集，可將抗原保留更長時間[24]。研究表明，尼羅羅非魚因感染無乳鏈球菌引起的腦膜炎時間變化為：在感染的2 d內(nèi)，未見明顯的神經(jīng)癥狀；而在感染3 d至以后幾天魚體出現(xiàn)異?；顒拥纳窠?jīng)癥狀及眼突、角膜渾濁等病理變化[25]；而這與感染了無乳鏈球菌后腦中的表達模式相符合，在腦中的表達量主要在48 h內(nèi)顯著上調(diào)，即在感染的12 h表達量到達峰值（6.4倍，< 0.01），在48 h出現(xiàn)表達量的次高峰,而在72 h和96 h表達量趨于平穩(wěn)。綜上可見，參與了尼羅羅非魚細菌感染的免疫應(yīng)答。

4 結(jié)論

從尼羅羅非魚中克隆并鑒定了干擾素調(diào)節(jié)因子4。OnIRF4有干擾素調(diào)節(jié)因子的典型結(jié)構(gòu)域：DBD和IAD。亞細胞定位顯示主要在細胞核中發(fā)揮功能。健康尼羅羅非魚的腦、肝臟、腸道和頭腎中的mRNA含量豐富。在細菌感染后的體內(nèi)表達呈時間依賴性上調(diào)。表明參與了細菌感染的免疫應(yīng)答。

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Cloning and Expression Analysis of Interferon Regulatory Factor 4 Gene () in

LUO Guo-lin1,2,3, MA Jia-ling1, MO Fang-ling1, CHEN Jun-xi1, LUO Wei-tao1, YANG Qing1, HUANG Yu1,2,3

(1.//2.// 3.524088,)

【】Interferon regulatory factor 4 (IRF4) plays a key role in innate and adaptive immune responses in mammals. 【】the IRF4 homologous from, namedwas identified. The amino acid sequence ofwas analyzed by bioinformatics analysis software. The expression pattern ofwas analyzed by Quantitative Real-time PCR in healthy fish and its biological effect was analyzed on bacterial infection by intraperitoneal injection of 200 μL(3×107CFU/mL) on healthy fish. 【】The open reading frame ofsequence is 1 350 bp, encoding 449 amino acids. It has a 52% - 98% homology with other IRF4 proteins. The derivedmature peptide has typical DNA binding domain (DBD) and interferon-associated domain (IAD) of interferon factors. The results of subcellular localization showed thatwas mainly located in the nucleus. Expression analysis showed thatwas distributed in all tissues of healthy tilapia. Afterinfection, the expression ofin the liver, spleen, head kidney and brain was significantly up-regulated (< 0.05), suggesting thatwas involved in the immune response of Nile tilapia to bacterial infection.

; interferon regulatory factor 4; gene expression;

Q78；Q959.483

A

1673-9159（2020）05-0019-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.003

2020-03-24

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（CXXL2019141）

羅國玲（1996－），女，碩士，研究方向為魚類免疫學(xué)。E-mail：1433792702@qq.com。

黃瑜（1986—），男，博士，研究方向為魚類免疫學(xué)。E-mail：huangyu@gdou.edu.cn。

羅國玲，馬嘉霖，莫芳玲，等. 尼羅羅非魚干擾素調(diào)節(jié)因子4基因的克隆與表達[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2020，40（5）：19-26.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）