GC-MS/MS測定化妝品中致敏香料新鈴蘭醛

易路遙 楊婷婷 李 杰 劉緒平 吉偉佳 占翌領(lǐng) 章 紅

(江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心, 南昌 330029)

香料是化妝品中使用次數(shù)最多，也是使用范圍最廣的一類添加劑，然而逐年增加的化妝品不良反應(yīng)[1，2]報(bào)道顯示，香料是引起皮膚病不良反應(yīng)的常見致敏物質(zhì)之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，化妝品過敏中至少有35%是由香料引起的[3]。新鈴蘭醛因具有持久的鈴蘭花香香韻和清淡而甜潤的兔耳草花香氣[4]，被廣泛用于各種香型香精的調(diào)配，在各種百花香型的香水、香皂和化妝品中均有使用[5]。然而，該物質(zhì)的過敏性已得到大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)及化妝品過敏的不良反應(yīng)案例支持[6，7]。2017年8月2日，歐盟委員會正式發(fā)布了(EU)2017/1410號法規(guī)[8]，在禁用物質(zhì)清單附錄II中增加了新鈴蘭醛( CAS 31906-04-4和CAS 51414-25-6兩個同分異構(gòu)體)。東盟化妝品委員會在2018年1月就正式發(fā)布指令禁止在化妝品中使用新鈴蘭醛。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015年版未將新鈴蘭醛列入禁用物質(zhì)表，考慮到歐盟是我國進(jìn)出口化妝品的重要市場，無論是從企業(yè)對外出口化妝品還是從未來化妝品的使用安全考慮，我國將新鈴蘭醛列入禁用組分表是必然的趨勢，因此盡早建立新鈴蘭醛的檢測方法十分必要。

目前我國新鈴蘭醛的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)不包含檢測方法[9]，文獻(xiàn)報(bào)道的氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[10，11]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[12，13]測定致敏性芳香劑及香料類過敏原物質(zhì)殘留的基質(zhì)分別為塑料玩具及化妝品，但文獻(xiàn)報(bào)道的化妝品的前處理過于簡單，缺乏凈化步驟，可操作性不強(qiáng)。歐盟檢測消費(fèi)品中香料過敏原的標(biāo)準(zhǔn)方法[14]有僅適用于直接定容進(jìn)樣基質(zhì)的GC-MS法、國外還有一些文獻(xiàn)報(bào)道[15,16]HPLC法及分散液液微萃取GC-MS法測定化妝品中其他過敏香料。本研究改進(jìn)了歐盟標(biāo)準(zhǔn)方法的樣品前處理，使用新型固相填料，采用通過式SPE凈化進(jìn)行樣品前處理，使檢測方法適用性更廣，再結(jié)合GC-MS /MS 聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行定性定量分析，由于化妝品基質(zhì)種類繁多，所含化學(xué)成分不下十幾種，采用二級質(zhì)譜在排除樣品基質(zhì)可能帶來的干擾更有優(yōu)勢，定性更加準(zhǔn)確，為化妝品中致敏香料的檢測提供科學(xué)可行的方法依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 7000C 三重串聯(lián)四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS/MS)(Agilentgs公司，美國)，彈性石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm,1.0μm)HP-5MS、(30m×0.25mm,0.25μm)HP-5MS、(50m×0.32mm,0.5μm)HP-FFAP、(30m×0.32mm,0.25μm)DB-17MS、(60m×0.32mm,0.5μm) HP-INNOWA ( Agilent 公司，美國)；離心機(jī)(ThermoFisher公司，美國)；渦旋混合器(IKA公司，德國)。

新鈴蘭醛對照品 (貨號C 14232000，批號：111528，新鈴蘭醛Ⅰ∶新鈴蘭醛Ⅱ=72∶28)購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；甲醇為色譜純(Sigma)；無水Na2SO4為分析純(國藥集團(tuán))；Oasis PRiME HLB(200mg,6mL)、Oasis PRiME MCX(150mg,6mL)、Oasis HLB(60mg,3mL)(waiers公司，美國)。

美白晚霜、天然純露保濕霜(兒童型)、淡斑乳、調(diào)理精華乳、凈膚修護(hù)乳、祛痘爽膚水、茶樹爽膚水、女士淡香水和少女香氛香水均為國產(chǎn)、男士香水為法國生產(chǎn)。

1．2 方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的制備

稱取新鈴蘭醛標(biāo)準(zhǔn)品0.1g( 精確至0.1mg，市面上僅有新鈴蘭醛同分異構(gòu)體的混合對照品，按照歸一化法 新鈴蘭醛Ⅰ∶新鈴蘭醛Ⅱ=72∶28換算各自的濃度) 至10mL棕色容量瓶中，甲醇定容，得到濃度為新鈴蘭醛Ⅰ7.2mg/mL和新鈴蘭醛Ⅱ2.8mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于4℃避光保存。

1.2.2供試品溶液的制備

稱取1.0 g(精確至0.001g)試樣置于25 mL比色管(有10 mL刻度)中，加入甲醇約5 mL，于超聲波清洗儀上超聲15 min，再定容到10mL，混勻，以10000 r/ min高速離心15 min，取上清液加入2 g無水Na2SO4脫水，取2mL清液作為待凈化液，置于通過式SPE小柱Oasis PRiME HLB(200mg,6mL)，直接收集流出液，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾,濾液供測定用(凝膠、爽膚水類樣品如基質(zhì)雜質(zhì)干擾較少，可不通過SPE小柱，取上清液直接過濾膜上機(jī)測定，香水類樣品取樣量為0.1 g)。

1.2.3色譜-質(zhì)譜條件

HP-5MS 毛細(xì)管柱(30m×0.25mm,1.0μm)，載氣為高純氦氣，流量為1.0mL/min ，程序升溫：初始溫度為60℃，保持2min 后以13℃/min 速率升至280℃，保持1min，進(jìn)樣口溫度為280℃ ，進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣，分流比5∶1 ；EI 質(zhì)譜測定條件: 70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃，碰撞氣體(N2)流量為1.5mL/min，淬滅氣體(He)流量為2.25 mL/min；溶劑延遲5min。數(shù)據(jù)采集方式: 多反應(yīng)監(jiān)測( MRM) ，目標(biāo)物對照品總離子流圖(TIC)及二級質(zhì)譜棒狀圖見圖1、圖2、圖3，目標(biāo)物離子對信息見表1。

圖1 新鈴蘭醛GC-MS/MS 總離子流色譜圖

圖2 新鈴蘭醛Ⅰ二級質(zhì)譜圖

圖3 新鈴蘭醛Ⅱ二級質(zhì)譜圖

表1 新鈴蘭醛Ⅰ和新鈴蘭醛Ⅱ質(zhì)譜信息

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化

在色譜條件建立過程中，首先針對氣相毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行了弱極性到極性的比較選擇，分別用液膜厚0.25μm 的HP-5MS毛細(xì)管柱、液膜厚1.0μm 的HP-5MS毛細(xì)管柱、DB-17MS毛細(xì)管柱、HP-INNOWAX毛細(xì)管柱及HP-FFAP毛細(xì)管柱對標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行分析，其中HP-5MS和DB-17MS出峰峰形較好，HP-5MS分離度較DB-17MS稍好，而HP-5MS液膜厚1.0μm比0.25μm的分離度更好，尤其表現(xiàn)在對大批量樣品溶液進(jìn)行分析時，故選擇液膜厚1.0μm的HP-5MS毛細(xì)管柱，而DB-17MS毛細(xì)管柱可以作為備選在必要時起到排除雜質(zhì)的作用，文獻(xiàn)[14]就是選擇了DB-17MS和VF-WAX兩種極性的毛細(xì)管色譜柱，本實(shí)驗(yàn)未選擇類似VF-WAX強(qiáng)極性的柱子，是考慮到實(shí)驗(yàn)對象沒有文獻(xiàn)[14]多，HP-5MS毛細(xì)管柱既能滿足本實(shí)驗(yàn)對象較好的分離又是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室必備的基礎(chǔ)氣相色譜柱，且較VF-WAX柱有極低的色譜柱流失特性，極高的耐高溫特性及壽命長等。

程序升溫比較了文獻(xiàn)[14]的方法：初始溫度為60℃，保持1min 后以3℃/min 速率升至230℃，然后10℃/min速率升至260℃考慮到歐盟的方法主要針對20幾個實(shí)驗(yàn)對象的同時分離，且所使用的色譜柱最高溫度限較低，所以設(shè)置了較緩的梯度，導(dǎo)致新鈴蘭醛直到40min左右才出峰，而實(shí)驗(yàn)中建立的程序升溫在16min附近即可出峰，分離度還優(yōu)于文獻(xiàn)[14]，且本實(shí)驗(yàn)選擇的色譜柱最高溫度限達(dá)350℃，可以在梯度后端直接上升到280℃高溫進(jìn)行快速的雜質(zhì)掃尾，故最終選擇速率程序升溫到280℃高溫的條件。

質(zhì)譜條件優(yōu)化先確定了新鈴蘭醛Ⅰ和Ⅱ一級質(zhì)譜SCAN模式下的基豐離子136和105為母離子，再采用反應(yīng)產(chǎn)物離子模式下設(shè)置梯度遞增碰撞電壓(5ev～40ev，10ev間隔)分別進(jìn)行轟擊，分析各電壓下的二級碎片離子強(qiáng)度，選擇較特征的二級定量及定性離子，再在多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下優(yōu)化各離子對的最佳碰撞電壓。

2.2 提取溶劑的選擇

化妝品的大部分方法均采用甲醇提取，前期簡單比較了甲醇和乙腈，甲醇極性大，適用的基質(zhì)會更廣一些，且考慮到氣相分析極少使用乙腈作為溶劑，乙腈毒性更大，就最終選擇了甲醇，由于要上氣相色譜，還增加了無水硫酸鈉除水的步驟，甲醇作為溶劑對氣相毛細(xì)管色譜柱會有一定溶解損傷，所以進(jìn)樣的時候設(shè)置分流比是有必要的。

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1SPE方案設(shè)計(jì)篩選

為了得到較干凈的樣品處理液，本研究考慮采用固相萃取這種目前通用的有機(jī)物凈化手段來進(jìn)行凈化，而為了建立專屬性好的SPE前處理方案，根據(jù)新鈴蘭醛化合物偏堿性的特征，試驗(yàn)設(shè)計(jì)比較PRiME HLB、PRiME MCX、HLB等不同填料的SPE柱，其中PRiME是新型適用于通過式處理方案的柱子，相對于傳統(tǒng)的SPE柱有更簡單、更快速、更潔凈的優(yōu)勢，針對3款SPE柱，分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品過柱、樣品基質(zhì)過柱、樣品基質(zhì)過柱后添加標(biāo)準(zhǔn)品、樣品基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)品過柱4種設(shè)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)選用霜、乳、爽膚水3種代表性基質(zhì)考察，標(biāo)準(zhǔn)品柱前柱后的添加量均使得最后上機(jī)的分析溶液濃度為4μg/mL。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)品過柱實(shí)驗(yàn)中，PRiME HLB回收率110.6%、HLB回收率83.4%、PRiME MCX回收率48.6%；樣品基質(zhì)過柱實(shí)驗(yàn)中，未過柱的霜和乳樣品溶液色譜圖干擾峰遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于過柱的，其中HLB去除干擾效果最佳，其次是PRiME HLB，PRiME MCX最多，爽膚水的3款柱子雜峰基本差不多；樣品基質(zhì)過柱后添加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)品過柱的實(shí)驗(yàn)中，通過提取后的樣品中目標(biāo)物峰面積與提取后加標(biāo)的樣品中目標(biāo)物峰面積之比計(jì)算回收率，霜和乳的PRiME HLB回收率105.0%～120.0%、HLB回收率56.5%～26.7%、PRiME MCX回收率80.5%～96.1%，爽膚水的PRiME HLB回收率110.0%、HLB回收率78.0%、PRiME MCX回收率97.1%，進(jìn)一步結(jié)合基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果綜合選擇最佳SPE柱。

2.3.2基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)的計(jì)算等于2.3.1方案設(shè)計(jì)中各樣品基質(zhì)過柱后加標(biāo)樣品的目標(biāo)物響應(yīng)與對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的響應(yīng)的百分比再減去100，如果結(jié)果為負(fù)數(shù)，則為基質(zhì)抑制，如果結(jié)果為正，則為基質(zhì)增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，霜和乳的基質(zhì)效應(yīng)PRiME MCX較強(qiáng)抑制(-68.1%～45.0%)，HLB和PRiME HLB為略微增強(qiáng)(18.0%～9.0%)，爽膚水的基質(zhì)效應(yīng)PRiME MCX一般抑制，HLB和PRiME HLB為略微增強(qiáng)。

綜合比較，最后選擇PRiME HLB(200mg 6ml)作為凈化柱。推薦測定過程中使用待測樣本相似的基質(zhì)的陰性溶液配制標(biāo)曲。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1基質(zhì)匹配工作標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，用甲醇配制合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)中間使用溶液，再用按照1.2.2方法制備的陰性基質(zhì)溶液配制基質(zhì)匹配工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度范圍新鈴蘭醛Ⅰ為0.36mg/L ～ 7.2mg/L，新鈴蘭醛Ⅱ?yàn)?.14mg/L ～ 2.58mg/L，注入設(shè)定好色譜質(zhì)譜條件的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按濃度從低到高依次進(jìn)行測定，以得到的定量離子色譜峰的峰面積(新鈴蘭醛Ⅰ：136.0/107.1，新鈴蘭醛Ⅱ：105.0/77.0)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如表2所示(霜基質(zhì)匹配工作曲線)，新鈴蘭醛Ⅰ和新鈴蘭醛Ⅱ在其線性范圍內(nèi)，濃度值與峰面積有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9900。

表2 新鈴蘭醛Ⅰ和新鈴蘭醛Ⅱ基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2精密度試驗(yàn)

精密量取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中間濃度點(diǎn)(新鈴蘭醛Ⅰ2.88mg/L，新鈴蘭醛Ⅱ1.12mg/L)的溶液，注入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定，記錄峰面積，計(jì)算新鈴蘭醛Ⅰ和Ⅱ均小于5%，儀器精密度滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.4.3回收率及重復(fù)性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選取了霜、乳、爽膚水及香水4種較為典型的化妝品基質(zhì)作為本底，分別設(shè)定了3 個添加濃度，霜、乳、爽膚水添加濃度為5mg/kg、10mg/kg、40mg/kg，香水添加濃度為50mg/kg、100mg/kg、400mg/kg，添加濃度以新鈴蘭醛Ⅰ計(jì)算，新鈴蘭醛Ⅱ按照比例計(jì)算，采用1.2項(xiàng)下的試驗(yàn)方法，對10mg/kg添加濃度平行6份試驗(yàn)，另外兩個添加濃度平行3份試驗(yàn)。由結(jié)果可知，方法對于不同化妝品基底物質(zhì)的回收率在80.0%～118.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 小于10%，其中重復(fù)6份回收試驗(yàn)新鈴蘭醛Ⅰ含量RSD為9.0%，新鈴蘭醛Ⅱ含量RSD為11.2%，方法重復(fù)性滿足試驗(yàn)需求。

2.4.4定量限實(shí)驗(yàn)

以響應(yīng)信號大于噪聲10 倍時對應(yīng)的標(biāo)液濃度作為儀器定量限，在測定膏、霜、乳類、凝膠、爽膚水類樣品時，新鈴蘭醛Ⅰ和Ⅱ方法定量限LOQ為0.1mg/kg，在測定香水樣品時，新鈴蘭醛Ⅰ和Ⅱ方法定量限LOQ為1mg/kg。

2.5 實(shí)際樣品的測定

采用建立的上述方法對10批樣品開展了分析，其中霜2批，乳液3批，爽膚水2批，香水3批，結(jié)果顯示，其中1批調(diào)理精華乳檢出20.4mg/kg，1批男士香水(歐盟)檢出110mg/kg，考慮乳類化妝品是混合香料中含有新鈴蘭醛香料，香水是一款歐盟禁用前生產(chǎn)的某知名品牌，應(yīng)為直接使用新鈴蘭醛進(jìn)行調(diào)香。

3 結(jié)論

本研究建立的是測定膏霜乳液類和液態(tài)水基類化妝品中新鈴蘭醛氣質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜測定的定量定性方法。對色譜質(zhì)譜條件及固相萃取方案進(jìn)行了優(yōu)化，完成了基質(zhì)效應(yīng)及方法學(xué)驗(yàn)證等評價(jià)，本實(shí)驗(yàn)方法將通過式SPE凈化處理方案與質(zhì)譜檢測結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了化妝品中致敏香料的快速檢測分析，該分析方法快速，準(zhǔn)確，選擇性好，為化妝品的質(zhì)量安全檢測提供了有效的技術(shù)手段。