正交試驗法優(yōu)選肉桂油的水蒸氣蒸餾法提取工藝

周雨晴，梁迪，杜沛霖

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧 530201；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200)

肉桂是樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹皮[1]，既是中藥，又能作為香料和防腐劑使用，是重要的藥食同源品種[2]。肉桂油為肉桂的揮發(fā)油，主要活性成分肉桂醛具有抗真菌[3]、抗細菌作用[4,5]，肉桂醛處理后能保持水果、海鮮等的新鮮度[6,7]，延長存儲時間，是良好的天然防腐劑[8]。肉桂醛沸點為253 ℃，比其他香料成分沸點高，香味更持久[9]，是制作道口燒雞、鹵料、火鍋底料的重要風(fēng)味貢獻物質(zhì)[10-12]。用得油率這個單一指標無法準確評價肉桂油的質(zhì)量，因此，本試驗以得油率和肉桂醛含量為指標，用正交試驗法優(yōu)化肉桂油的水蒸氣蒸餾法提取工藝。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

肉桂(批號20150901)：北京同仁堂健康藥業(yè)(福州)有限公司；肉桂醛對照品(批號110710-201619)：中國食品藥品檢定研究院；甲醇(分析純，批號20150604)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純)；水(超純水)。

1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；DFY-800型搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司；BS224S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TGL-16G型離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 肉桂醛測定方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈∶水為35∶65(V/V)，檢測波長為290 nm，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，洗脫時間為等度洗脫30 min，柱溫為35 ℃。

2.1.2 對照品溶液的制備

稱取適量肉桂醛對照品，精密稱定，加入甲醇配制成濃度為0.328 mg/mL的肉桂醛對照品儲備液。精密移取肉桂醛對照品儲備液1 mL，置于25 mL容量瓶中定容，搖勻，即可得到每1 mL含肉桂醛13.12 μg的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

參照2.3正交試驗優(yōu)選條件提取肉桂油，以5000 r/min離心10 min，吸去上層清水，精密稱定后，用甲醇定容至50 mL，作為樣品溶液，精密移取0.5 mL樣品溶液，用甲醇定容至50 mL，再次精密移取0.5 mL稀釋后的樣品溶液，用甲醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

2.1.4 空白對照溶液的制備

取甲醇適量，經(jīng)微孔濾膜過濾處理，按2.1.1色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。

2.1.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各10 μL，按2.1.1色譜條件進行測定，結(jié)果見圖1。

圖1 對照品、供試品、空白對照溶液的HPLC圖Fig.1 HPLC diagrams of control sample, test sample and blank control solution

由圖1可知，肉桂醛對照品的出峰時間為18 min，而空白對照溶液在此保留時間無吸收峰，說明背景溶液不干擾肉桂醛的含量測定。

2.1.6 方法學(xué)考察

2.1.6.1 線性關(guān)系考察

取2.1.2項下的肉桂醛對照品溶液適量，分別進樣4，6，8，10，12，14 μL。按2.1.1色譜條件測定，結(jié)果見表1。以肉桂醛峰面積(A)為縱坐標，以進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，見圖2?；貧w方程為：Y=11361.5237X+0.0194414(r2=1.00000)，肉桂醛在0.052～0.182 μg范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

表1 肉桂醛對照品測定結(jié)果Table 1 The determination results of cinnamaldehyde reference substance

圖2 肉桂醛標準曲線圖Fig.2 The standard curve of cinnamaldehyde

2.1.6.2 精密度試驗

精密吸取肉桂醛對照品溶液，參照2.1.1色譜條件，進樣量為10 μL，測得峰面積的平均值為1516.7，RSD值為0.04%，結(jié)果顯示本方法精密度良好。

2.1.6.3 重復(fù)性試驗

取同一批次的肉桂粉末6份，每份60 g，同法制備肉桂油供試液，按2.1.1色譜條件進樣，測得峰面積平均值為1699.3，RSD值為1.89%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.6.4 穩(wěn)定性試驗

精密量取肉桂油供試品，分別于0，4，8，12，16，24 h，按2.1.1色譜條件試驗，每次進樣量為10 μL。計算其RSD值為0.60%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6.5 加樣回收試驗

取6份已知含量(2.4257%)的肉桂粉末，每份30 g，精密稱定后，分別加入與樣品中肉桂醛含量相近的對照品溶液，采用優(yōu)選的最佳方案提取肉桂油后按2.1.3供試品溶液的制備方法處理，并按2.1.1色譜條件測定肉桂醛的含量。計算回收率，得平均回收率為100.91%，RSD值為2.61%，結(jié)果見表2。

表2 肉桂醛回收率試驗結(jié)果Table 2 Results of cinnamaldehyde recovery test

2.2 單因素考察

2.2.1 藥材粉碎度的考察

取原藥材飲片粉碎過4，10，24，50，65目篩的肉桂粉末各60 g，加入10倍水，分別浸泡30 min，加熱回流5 h，并按2.1.3項下方法處理肉桂油樣品，計算肉桂油得率，并按2.1.1色譜條件進樣測定肉桂醛含量，比較肉桂醛含量和肉桂油得率選出最優(yōu)粉碎度，結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 藥材粉碎度對肉桂醛含量的影響Fig.3 Effect of crushing degree of medicinal materials on cinnamaldehyde content

圖4 藥材粉碎度對肉桂油得率的影響Fig.4 Effect of crushing degree of medicinal materials on cinnamon oil yield

由圖3和圖4可知，藥材粉碎度越高，肉桂醛含量和肉桂油得率越低，原因可能是肉桂油是易揮發(fā)性物質(zhì)，肉桂粉碎過細，粉碎時間長，從而導(dǎo)致肉桂油在粉碎過程中流失，因此選擇4，10，24目作為正交試驗考察水平。

2.2.2 浸泡時間的考察

取24目肉桂粉末5份，每份60 g，加10倍水，分別浸泡0，30，60，90，120 min，加熱回流5 h，并按2.1.3項下方法處理肉桂油樣品，計算肉桂油得率，并按2.1.1色譜條件進樣測定肉桂醛含量，比較肉桂醛含量和肉桂油得率選出最優(yōu)浸泡時間，結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 藥材浸泡時間對肉桂醛含量的影響Fig.5 Effect of soaking time of medicinal materials on cinnamaldehyde content

圖6 藥材浸泡時間對肉桂油得率的影響Fig.6 Effect of soaking time of medicinal materials on cinnamon oil yield

由圖5和圖6可知，藥材浸泡時間對肉桂醛含量和肉桂油得率均有一定的影響，浸泡時間越長，肉桂醛含量越高，而肉桂油得率有所下降，因此綜合考慮后，選擇浸泡30，60，90 min作為正交試驗考察水平。

2.2.3 加水量的考察

取24目肉桂粉末5份，每份60 g，分別加4，6，8，10，12倍水浸泡30 min，蒸餾5 h，并按2.1.3項下方法處理肉桂油樣品，計算肉桂油得率，并按2.1.1色譜條件進樣測定肉桂醛含量，比較肉桂醛含量和肉桂油得率選出最優(yōu)加水倍數(shù)，結(jié)果見圖7和圖8。

圖7 藥材加水倍數(shù)對肉桂醛含量的影響Fig.7 Effect of water addition times of medicinal materials on cinnamaldehyde content

圖8 藥材加水倍數(shù)對肉桂油得率的影響Fig.8 Effect of water addition times of medicinal materials on cinnamon oil yield

由圖7和圖8可知，加水量過少，藥材浸泡不完全且容易粘鍋，肉桂醛難以提取完全；而加水量過多，肉桂油易隨著蒸餾水揮發(fā)，肉桂醛含量和肉桂油得率均有所下降，因此選擇加水6，8，10倍作為正交試驗考察水平。

2.2.4 蒸餾時間的考察

取24目肉桂粉末5份，每份60 g，加10倍水浸泡30 min，分別加熱回流3，4，5，6，7 h，并按2.1.3項下方法處理肉桂油樣品，計算肉桂油得率，并按2.1.1色譜條件進樣測定肉桂醛含量，比較肉桂醛含量和肉桂油得率選出最優(yōu)蒸餾時間，試驗結(jié)果見圖9和圖10。

圖9 藥材蒸餾時間對肉桂醛含量的影響Fig.9 Effect of distillation time of medicinal materials on cinnamaldehyde content

圖10 藥材蒸餾時間對肉桂油得率的影響Fig.10 Effect of distillation time of medicinal materials on cinnamon oil yield

由圖9和圖10可知，肉桂醛含量和肉桂油得率均隨蒸餾時間的增加而呈上升趨勢，在蒸餾時間達到6 h后，肉桂醛含量和肉桂油得率有所下降，說明在蒸餾過程中，時間過長，肉桂醛含量會有所損失，因此為節(jié)約生產(chǎn)成本，選擇蒸餾4，5，6 h作為正交試驗考察水平。

2.3 正交試驗

參考文獻[13-15]，設(shè)計水蒸氣蒸餾法提取肉桂油的正交試驗。選擇藥材粉碎度(A)、浸泡時間(B)、加水倍數(shù)(C)、蒸餾時間(D)為考察因素，每個因素設(shè)3個水平進行L9(34)正交試驗。

準確稱取肉桂粉末9份，每份60 g，按L9(34)正交試驗條件提取肉桂油，按2.1.3項下方法處理肉桂油樣品，并按2.1.1色譜條件測定肉桂醛含量，試驗因素水平設(shè)計見表3，正交試驗結(jié)果見表4，肉桂醛含量方差分析表見表5，肉桂油得率方差分析表見表6。

表3 正交試驗因素水平設(shè)計Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

表4 L9(34)正交試驗結(jié)果Table 4 The results of L9(34) orthogonal experiment

表5 肉桂醛含量方差分析表Table 5 The variance analysis of cinnamaldehyde content

表6 肉桂油得率方差分析表Table 6 The variance analysis of cinnamon oil yield

根據(jù)正交試驗所得結(jié)果分別對肉桂醛含量和肉桂油得率進行直觀分析和方差分析，由表4直觀分析結(jié)果可知，影響肉桂油提取工藝的因素順序為加水倍數(shù)(C)>粉碎度(A)>蒸餾時間(D)>浸泡時間(B)，綜合考慮肉桂醛含量和肉桂油得率結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉桂醛含量在浸泡90 min時比浸泡60 min時高一點，但經(jīng)t檢驗法計算，兩者之間無顯著性差異，因而為節(jié)約生產(chǎn)成本，選擇最優(yōu)浸泡時間為60 min，確定最佳工藝組合為A2B2C1D3。以R值最小的B因素為誤差項進行肉桂醛含量方差分析估算，只有加水倍數(shù)對提取結(jié)果具有顯著性影響，且蒸餾6 h與蒸餾5 h的肉桂油含量差異不大，而對肉桂油得率進行方差分析估算發(fā)現(xiàn)除了加水倍數(shù)，粉碎度對提取結(jié)果也有顯著性影響。因此綜合考慮工業(yè)上的生產(chǎn)，最后確定肉桂油的最佳提取工藝為A2B2C1D2，即藥材粉碎度10目，浸泡60 min，加6倍水，蒸餾5 h。

2.4 樣品含量測定

按優(yōu)選的最佳提取方案，進行了3 批驗證試驗：取10目肉桂粉末3份，過10目篩，浸泡60 min，加6倍水，蒸餾5 h，提取肉桂油，結(jié)果見表7。

表7 樣品中肉桂醛含量和得油率Table 7 The cinnamaldehyde content and cinnamon oil yield in the samples

由表7可知，肉桂醛含量測定平均值為2.4343%，RSD為1.52%，得油率平均值為3.1282%，表明優(yōu)選出的組合A2B2C1D2工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)果與討論

肉桂醛是易揮發(fā)成分，粉碎越細，粉碎時間越長，提取物中含量越小，因此應(yīng)盡量減少粉碎度，縮短粉碎時間。浸泡可以使肉桂組織細胞膨脹，細胞間隙變大，加速揮發(fā)油從藥材中滲出，從而利于揮發(fā)油的提取。但過長的浸泡時間也會使揮發(fā)油從提取溶劑中析出、揮發(fā)，造成揮發(fā)油的損失。

揮發(fā)油提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、無溶劑微波蒸餾法、超聲輔助溶劑萃取法、超臨界CO2流體提取法[16]、微波提取法[17,18]、亞臨界水萃取法等[19]，本試驗采用的水蒸氣蒸餾法成本低，綠色環(huán)保，可為肉桂油的提取提供一定技術(shù)參考。

肉桂醛是肉桂揮發(fā)油中發(fā)揮藥效的重要成分和指標，用得油率這一單一指標評價肉桂揮發(fā)油不盡合理，因此，本試驗設(shè)計加入肉桂醛含量這一指標，綜合篩選出最佳的提取工藝：粉碎度10目，浸泡60 min，加6倍水，蒸餾5 h，得油率為3.1282%，肉桂醛含量為2.4343%。