基質(zhì)金屬蛋白酶-8在尋常型銀屑病患者血清及皮損中的表達(dá)研究

林路洋, 田歆, 張三泉, 陳曉吟, 梁艷華, 畢超, 譚劍萍, 張錫寶

(廣州市皮膚病防治所,廣東 廣州 510095)

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)屬于一組結(jié)構(gòu)相似、依賴金屬Zn2+實現(xiàn)其蛋白酶活性的肽鏈內(nèi)切酶家族。在生理情況下，MMPs轉(zhuǎn)錄處于低水平，但當(dāng)發(fā)生組織損傷，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，其局部表達(dá)水平迅速上升，因此MMPs是機(jī)體對外刺激產(chǎn)生宿主免疫的重要組成部分，其主要功能是調(diào)控一些非基質(zhì)蛋白活性，如：細(xì)胞因子、生長因子、抗菌肽、趨化因子等[1]。MMPs在尋常型銀屑病(psoriasis vugaris,PV)中的作用主要包括調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、組織重塑、細(xì)胞遷移及血管擴(kuò)張及血管新生[2]。近來有研究表明MMP-8與免疫細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞增殖及遷移、血管新生相關(guān)[3-5]，上述均為PV的典型病理改變。為探究MMP-8在PV中的作用，本研究觀察了PV患者血清及皮損中MMP-8的表達(dá)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

納入2018年12月至2019年8月來我院皮膚病門診就診并進(jìn)行病理檢查的PV患者20例，均符合最新銀屑病診療指南[6],排除近1個月有系統(tǒng)性用藥史者。其中男16例，女4例；年齡11～77歲，平均(37.10±17.56)歲；病程1個月～13年，平均(4.03±4.31)年。按銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index,PASI)評分分組[7-8]:輕度組(PASI<3)6例；中度組(3≤PASI<10)6例；重度組(PASI≥10)8例。對照血清取自我院職工體檢健康者，共12例，其中男9例，女3例；年齡25～53歲，平均(36.67±9.69)歲。對照組與患者組性別(2=0.11,P=0.74)、年齡(t=0.09,P=0.929)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過(批件號：201502)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

MMP-8 ELISA試劑盒(R&D Minneapolis, MN， lot: 286200)；小鼠抗人MMP-8一抗(Abcam公司,Cat:ab53017),山羊抗小鼠IgG二抗(Sigma公司,Cat: A3562)；mRNA提取試劑盒(賽默飛公司,Cat: 61006)。酶標(biāo)儀(愛康Uranuas AE 120)；PCR儀(ABI-7500型熒光定量PCR儀)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS BX51)。

1.3 方法

1.3.1 ELISA檢測患者及對照血清中MMP-8水平 用普通干燥管采集患者及正常對照組靜脈血5 mL，250 g離心10 min，分離血清，用稀釋液1∶4稀釋(均用復(fù)孔檢測)后加入200 μL至微孔，同時設(shè)置MMP-8梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品對照；震蕩器混勻，室溫孵育2 h，用洗液洗4次；加入200 μL酶標(biāo)抗體，混勻，室溫孵育2 h；洗4次，加入底物200 μL，室溫孵育30 min；加入終止液50 μL終止反應(yīng)，30 min內(nèi)在450 nm波長下讀取吸光度值；用標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各樣本濃度。

1.3.2 熒光定量PCR檢測皮膚組織MMP-8表達(dá) 取皮損部位及相鄰未受累外觀正常皮膚提取mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，用熒光定量PCR方法(探針法)檢測MMP-8；MMP-8引物由達(dá)安公司合成并進(jìn)行Q-PCR實驗，引物序列：forward: 5′-CCATCTATGGACTTTCAAGCAAC-3′；reverse：5′-TTGGAAGGGATGGCCAGAATAG-3′；以甘油三磷酸脫氫酶(GPADH)為內(nèi)參，用公式2-ΔΔCt計算樣品中MMP-8相對量。

1.3.3 免疫組化觀察皮損中MMP-8的表達(dá) 取皮損部位及相鄰未受累外觀正常皮膚各0.5 mm×0.5 mm大小皮膚組織,進(jìn)行石蠟切片，然后行免疫組化染色：經(jīng)3%過氧化氫封閉30 min，消化內(nèi)源性過氧化氫酶；抗原修復(fù)后加入MMP-8一抗(稀釋度1∶300)，4 ℃過夜；PBS洗3次，加入二抗(稀釋度1∶50)37 ℃孵育1 h；PBS洗3次；加入DAB顯色，在顯微鏡下觀察并及時終止反應(yīng)。顯微鏡下觀察皮損部位及相鄰未受累表皮內(nèi)MMP-8的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)選用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計分析及繪圖，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中MMP-8濃度比較

對照組血清中MMP-8濃度為(3.788±1.101) ng/mL,PV組MMP-8濃度為(4.143±2.272) ng/mL,兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.66,P=0.510)。輕度組MMP-8濃度低于對照組(t=2.54,P=0.022)、重度組(t=2.69,P=0.020)；中度組與對照組、輕度組、重度組間MMP-8濃度均無明顯差異(t值分別為0.76、1.99、0.83，P值均>0.05)；重度組與對照組及中度組間MMP-8濃度均無明顯差異(t值分別為0.83、1.99，P值均>0.05),詳見圖1。

圖1 PV患者和對照組血清MMP-8濃度Fig.1 MMP-8 concentrations in the serum of control and PV groups.

2.2 MMP-8-cDNA熒光定量檢測

皮損部位MMP-8表達(dá)明顯高于皮損鄰近部位外觀正常皮膚(t=2.91,P=0.009)，詳見圖2。重度組PV皮損部位MMP-8表達(dá)明顯高于輕度組(t=3.45,P=0.005)及中度組(t=2.74,P=0.018)，詳見圖3。重度組與輕度組、中度組(t值分別為1.58、1.10,P值均>0.05)以及輕度組與中度組(t=1.00,P>0.05)非皮損部位MMP-8表達(dá)均無明顯差異。

圖2 PV患者皮損和皮損鄰近部位正常皮膚MMP-8的相對表達(dá)量Fig.2 Comparision of MMP-8 expressions in non-lesional versus leisonal skin.

圖3 PV各組皮損中MMP-8的相對表達(dá)量Fig.3 MMP-8 expressions in the skin lesions of different groups.

2.3 免疫組化觀察MMP-8在PV患者皮損中的表達(dá)

PV患者皮損部位中，MMP-8陽性細(xì)胞主要位于基底層及棘細(xì)胞；而非皮損部位中，MMP-8陽性細(xì)胞主要位于表皮基底層。皮損及非皮損部位真皮淺層增生血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞均高表達(dá)MMP-8，見圖4。

圖4 MMP-8免疫組化(400×,箭頭指示為MMP-8陽性細(xì)胞)

3 討論

一般認(rèn)為，MMPs的主要功能是參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的降解、轉(zhuǎn)化和分解代謝。但近年來研究表明ECM的降解及轉(zhuǎn)化不是MMPs唯一功能，甚至不是主要病理生理學(xué)功能，越來越多的學(xué)者認(rèn)為MMPs是機(jī)體對外部刺激(如外傷、感染性病原體、自身免疫性抗體非生理性暴露等)產(chǎn)生的宿主免疫(包括先天性免疫和獲得性免疫)的重要組成部分[9-12]。MMPs在銀屑病炎癥反應(yīng)中的作用是通過調(diào)控一些關(guān)鍵免疫細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子如IL-17、IL-22等來實現(xiàn)的[2],研究較多的是MMP-2、MMP-9等在銀屑病中的作用[13-15],較少涉及MMP-8。MMP-8與免疫細(xì)胞浸潤及上皮細(xì)胞增殖、遷移有關(guān)，在病理狀況，如外傷、炎癥等情況下，角質(zhì)生成細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞都能表達(dá)MMP-8[16-17]，另外MMP-8有可能通過促進(jìn)血管新生參與PV的免疫病理進(jìn)程[5]。

本研究結(jié)果顯示，PV患者皮損部位MMP-8表達(dá)明顯高于鄰近外觀正常的皮膚，提示MMP-8在炎癥反應(yīng)較劇烈的皮損部位較炎癥反應(yīng)較輕的部位表達(dá)高；在癥狀嚴(yán)重PV患者皮損部位較癥狀較輕患者中表達(dá)高，提示PV患者皮損MMP-8表達(dá)與炎癥反應(yīng)程度及病情嚴(yán)重程度呈一定的正相關(guān)關(guān)系。血清檢測結(jié)果顯示，重度組外周血中MMP-8濃度高于輕度組，但對照組外周血MMP-8濃度反而高于輕度組，原因可能是皮損局部MMP-8產(chǎn)生細(xì)胞種類較多，如角質(zhì)形成細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，且與炎癥反應(yīng)程度密切相關(guān)，而外周循環(huán)中的MMP-8主要由中性粒細(xì)胞合成分泌[18-19]，因此外周血MMP-8濃度并不一定能反映皮損局部炎癥反應(yīng)情況，即外周血MMP-8濃度還不能作為一種生物標(biāo)記用于PV的診斷及病情評估。免疫組化結(jié)果顯示，皮損部位的棘細(xì)胞層表達(dá)MMP-8較明顯，而非皮損部位MMP-8主要在基底細(xì)胞表達(dá)，提示可能由于棘細(xì)胞層增生活躍，MMP-8表達(dá)升高；另外，皮損及非皮損部位真皮乳頭層的增生小血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP-8表達(dá)明顯，提示皮損附近皮膚雖無肉眼可見炎癥反應(yīng)，如紅腫等，但增生的小血管上皮均高表達(dá)MMP-8,提示MMP-8與PV皮損及附近部位血管新生功能相關(guān)。

本研究初步了解了MMP-8在PV炎癥性皮損中的表達(dá)及外周血水平情況。在PV由急性炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)槁赃w延過程中,MMP-8的表達(dá)變化、作用機(jī)制以及是否可作為一個新的治療靶點等問題，仍需進(jìn)一步開展各種體外及體內(nèi)實驗研究，為臨床上PV炎癥反應(yīng)的控制提供新的思路。

致謝：非常感謝中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院徐琳教授給予統(tǒng)計學(xué)方面的指導(dǎo)。