泛素結(jié)合酶抑制劑對豬精子獲能狀態(tài)及精卵結(jié)合能力的影響

程咪咪，汪秋月，呂艷秋，金 一

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000）

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-Proteasome System，UPS）介導(dǎo)的蛋白降解是通過小分子伴侶蛋白泛素（Ubiquitin，Ub）共價連接，對靶蛋白進(jìn)行穩(wěn)定、可逆的翻譯后修飾，負(fù)責(zé)執(zhí)行這個調(diào)控過程的關(guān)鍵組分包括泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）、泛素連接酶（E3）以及去泛素化酶（DUB）和26S 蛋白酶體[1-3]。E2 具有高度保守的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（UBC），UBC 上有象征活性的半胱氨酸位點，可以接受被 E1 激活的Ub，并與Ub 之間形成硫酯鍵。隨后，Ub-E2 與已識別待降解靶蛋白的E3 相結(jié)合，E3 介導(dǎo)Ub 從E2 轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，E2 和E3 繼續(xù)重復(fù)上述過程，直到靶蛋白上的多個Ub連接成一條多聚鏈，最后該靶蛋白被26S 蛋白酶體識別和降解。Uev1A 屬于E2 家族的一員，因為不存在活性E2 所必需的半胱氨酸位點，所以只能與Ubc13 結(jié)合形成Ubc13-Uev1A 復(fù)合物發(fā)揮作用。NSC697923 是一種細(xì)胞選擇透過性Ubc13-Uev1A 復(fù)合物抑制劑，能抑制Ub-E2 硫酯鍵的形成，從而阻止Ub 向底物的轉(zhuǎn)移[4]。

獲能是精子成熟的重要步驟之一，最具代表性的變化是超激活運動。在獲能期間，即精子與卵母細(xì)胞質(zhì)膜融合之前，精子獲得識別、結(jié)合并穿透透明帶的能力[5-6]。目前對人類和哺乳動物精子的研究揭示了UPS 可能參與精子超激活運動和獲能并由此調(diào)節(jié)精子與卵母細(xì)胞相互作用[7-11]，但UPS 調(diào)節(jié)精子獲能的具體機制尚不清楚。因此本研究通過在豬精子獲能液中添加E2 抑制劑NSC697923，探究精子蛋白泛素化水平對精子獲能狀態(tài)和精卵結(jié)合能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取延吉市某豬場年齡相似，健康無疾病的3 頭種豬。

1.2 主要試劑 實驗所用試劑無特殊說明均購自美國Sigma 公司，實驗所用水均制自超純水器（Milli-Q Academic A10），NSC697923 購自Selleckchem 公司，精子獲能液（每1L 配6.61 g NaCl、0.223 g KCl、1.102 g CaCl2、1.98g葡萄糖、1.942 9 g咖啡因、0.55 g丙酮酸鈉，2.42 g Tris、1g BSA、0.065 g 青霉素、0.05 g 鏈霉素），IVM 液（每1L 配15 g TCM-199l、0.549 6 g 葡萄糖、0.1 g丙酮酸、2.106 g NaHCO3、1 g 聚乙烯醇、0.075 g 青霉素、0.05 g 鏈霉素），TCM-washing 液（每1L IVM 液配6 g Hepes）和PBS-PVA 液（每1 L 配10g PBS 和1g PVA）。

1.3 實驗方法

1.3.1 精液獲取 從種豬場取回的新鮮精液在室溫下平衡30 min，用PBS 調(diào)節(jié)精子密度為1×108個/mL。取出一部分進(jìn)行常規(guī)檢測（精子質(zhì)量分析儀，購自圣普醫(yī)療設(shè)備有限公司），其中活力≥85%，精子畸形率≤20%，顏色呈淺灰或者乳白色，氣味略帶有腥味的樣品方可進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2 精子獲能 采用精子上浮法進(jìn)行精子獲能。取6個1.5 mL 無菌離心管，編號1～6，分別為空白對照組（未添加任何試劑）、陰性對照組（添加DMSO）和4 個NSC697923 處理組（5、10、15、20 μmol/L NSC697923），依次往6 個無菌離心管中加入經(jīng)PBS 清洗后的精液1 mL，600 r/min 離心2～3 min，棄去上清液，向各組沉淀中依次加入1 mL 精子獲能液，混勻，調(diào)整精子密度為1×108個/mL，除空白對照組外依次添加DMSO、不同濃度的E2 抑制劑NSC697923（5、10、15、20 μmol/L），將所有的離心管傾斜45°放入恒溫培養(yǎng)箱（TC2323）中，38.5℃，5%的CO2濃度下孵育45～60 min。

1.3.3 誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)（Acrosomal Reaction，AR）及考馬斯亮藍(lán)染色 分別將最終濃度為2 μmol/L 的鈣離子載體（誘導(dǎo)組）和DMSO（未誘導(dǎo)組）加入到已獲能的精子中，并在38.5℃、5% CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育30 min，后用考馬斯亮藍(lán)R250 避光染色30 min，流水沖洗甩干后，于光學(xué)顯微鏡下觀察精子發(fā)生AR 的比例。

1.3.4 卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus-Oocyte-Complex es，COCs）的獲取及卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)（In Vitro Maturation，IVM）挑選直徑3～6 mm 卵泡用注射器（20 mL）吸取其內(nèi)的卵泡液。將抽取到的卵泡液緩緩打入無菌的15 mL 離心管內(nèi)，放入37℃水浴鍋中。在收集所有卵泡液后，將離心管置于38.5℃培養(yǎng)箱中靜置30 min，然后用巴士吸管吸出并棄上清，之后緩慢加入10 mL TCM-washing 液，輕輕混勻后放入38.5℃培養(yǎng)箱中靜置10 min，取出，棄去上清液，緩慢加入8 mL TCM-washing 液，倒入90 mm 培養(yǎng)皿中，在附帶38.5℃恒溫板的顯微鏡下挑選3 層以上、卵丘細(xì)胞致密、胞質(zhì)均勻的COCs。用撿卵針將若干COCs 依次用在38.5℃培養(yǎng)箱中預(yù)平衡2 h 以上的TCM-washing 液、PBSPVA 液和IVM 液清洗3～5 次，然后將所選的優(yōu)質(zhì)COCs放入IVM 成熟滴，25～30 個/小滴（IVM 液70 μL/小滴，覆蓋礦物油，平衡2 h 以上），于38.5℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.5 卵母細(xì)胞的成熟判定 培養(yǎng)44 h 后進(jìn)行 IVM 判定，在0.1%透明質(zhì)酸酶中用1 mL 移液器輕輕反復(fù)吸吹COCs，在體式顯微鏡下挑選排出第一極體的M Ⅱ期成熟卵母細(xì)胞。

1.3.6 精子蛋白的提取 將各組精子懸浮液3 000 r/min離心3 min，棄上清，按1:100（v/v）的比例加入蛋白酶抑制劑PMSF 和裂解液RIPA 并混勻，用振蕩器震蕩3 min后，置于搖床40 min，12 000 r/min、4℃離心10 min，吸取上清，提取精子蛋白于-80℃冰箱中保存待用。

1.3.7 免疫印跡 用15%梯度凝膠SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法分離各組的蛋白，PVDF 膜經(jīng)TBST 最后清洗3 次后，添加一抗（兔抗Ub 抗體、小鼠抗GAPDH 抗體）在4℃下孵育14～18 h。再用TBST清洗3 次后，添加二抗（山羊抗兔IgG 過氧化物酶抗體、山羊抗小鼠IgG 過氧化物酶抗體）在室溫下?lián)u床上孵育2 h。用ECL 法處理PVDF 膜顯現(xiàn)蛋白條帶，固定拍照保存。通過ImageJ 軟件對PVDF 膜條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.3.8 精子黏附率檢測 分別吸取20 μL 各組精液，注入到M Ⅱ期卵母細(xì)胞10 個/受精滴的90 mm 培養(yǎng)皿（依次按分組標(biāo)記）中，進(jìn)行精子-卵母細(xì)胞結(jié)合試驗，然后置于38.5℃、5% CO2，最大飽和濕度培養(yǎng)箱中共孵育6 h，取出各組的卵母細(xì)胞用0.1% PVA-PBS 液洗滌3～5 次，然后用5%的戊二醛固定30 min，再用PVAPBS 液清洗3～5 次，最后用Hoechst 33342（碧云天生物技術(shù)研究公司）染色15 min，在熒光顯微鏡下對每個組的卵母細(xì)胞的附著精子數(shù)進(jìn)行拍照并計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析 使用Image J 軟件對WB 條帶灰度值和Hoechst 33342 熒光染色結(jié)果進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)使用SPSS 24 軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，差異顯著標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 精子發(fā)生獲能和頂體反應(yīng)判定 精子經(jīng)獲能和頂體反應(yīng)處理后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，已發(fā)生頂體反應(yīng)的精子頂體未被染色，未發(fā)生頂體反應(yīng)的精子頂體呈現(xiàn)藍(lán)紫色（圖1-A），鈣離子載體誘導(dǎo)組的頂體反應(yīng)率顯著高于未誘導(dǎo)組（圖1-B）。然后分別對鮮精、獲能精子以及頂體反應(yīng)精子進(jìn)行免疫印跡分析，用p32 酪氨酸磷酸化一抗和酶標(biāo)二抗孵育后，結(jié)果如圖2-A 所示，分子量約為32 ku 處出現(xiàn)蛋白條帶；分析蛋白條帶的灰度值結(jié)果如圖2-B 所示，獲能精子和頂體反應(yīng)精子的p32 酪氨酸磷酸化水平顯著高于鮮精組。

2.2 獲能對精子蛋白泛素化水平的影響 檢測精子獲能狀態(tài)后，對鮮精、獲能精子、頂體反應(yīng)精子蛋白重新進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果如圖3 所示，鮮精組在30 ku 處標(biāo)記出Ub-蛋白條帶，而獲能和頂體反應(yīng)組在30 ku 和46 ku 處均標(biāo)記出Ub-蛋白條帶；獲能精子組和頂體反應(yīng)組精子蛋白總泛素化水平顯著高于鮮精組，表明精子獲能或頂體反應(yīng)時伴隨著精子蛋白泛素化水平上調(diào)。

2.3 不同濃度E2 抑制劑對精子蛋白泛素化水平的影響如圖4 所示，在30 ku 和46 ku 處均標(biāo)記出Ub-蛋白條帶，空白對照組和陰性對照組間精子蛋白泛素化水平差異不顯著，NSC697923 處理組與對照組相比精子蛋白泛素化水平差異顯著。

2.4 不同濃度E2 抑制劑對精子獲能狀態(tài)的影響 如圖5所示，分子量約為32 ku 處僅有對照組出現(xiàn)蛋白條帶，NSC697923 處理組與對照組相比沒有精子蛋白磷酸化，表明獲能液中添加E2 抑制劑未能真正引起獲能。

2.5 不同濃度E2 抑制劑對精卵結(jié)合能力的影響 如圖6所示，隨著NSC697923 濃度的增加，藍(lán)色熒光點數(shù)逐漸增加。使用 Lane1 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7 所示，添加NSC697923 處理組的精子黏附率顯著低于對照組。

3 討 論

Tardif 等[12]研究發(fā)現(xiàn)在豬精子獲能期間，p32 的酪氨酸磷酸化含量增加。在此基礎(chǔ)上，Kwon 等[13]提出p32 的磷酸化在調(diào)節(jié)精子獲能方面起著關(guān)鍵作用，并可作為精子獲能的生物標(biāo)志物，這一觀點目前已得到公認(rèn)。本實驗發(fā)現(xiàn)精子獲能標(biāo)志物的p32 酪氨酸磷酸化水平顯著高于新鮮精液，表明精子得到有效獲能。

由于UPS 在生物體的生理和病理過程中發(fā)揮了重要的作用，泛素化異常會導(dǎo)致疾病發(fā)生，特別是腫瘤的發(fā)生。因此，近年來研究人員已經(jīng)開始逐漸將腫瘤的治療靶點轉(zhuǎn)向了UPS[4]，尤其是針對 E3、26S 蛋白酶體和DUB 而研發(fā)了新型的抗腫瘤藥物。針對UPS進(jìn)行的藥物開發(fā)中，E2 抑制劑主要有兩大類：一是從海綿動物中提取出的環(huán)狀肽 Leucettamol A、化合物Manadosterols A 和B，都被證實能通過阻斷 Ubc13 與UEV1A 的相互作用，從而抑制 Ubc13-UEV1A 復(fù)合體的形成，最終阻止K63 型多聚泛素鏈的形成，抑制底物降解。另有2 種Ubc13 抑制劑NSC697923 和BAY 11-7082，被證實可以通過在 Ubc13 活性位點半胱氨酸殘基上，經(jīng)過邁克爾加成反應(yīng)形成共價加合物，分別抑制 DNA 損傷和 NF-κB 信號通路[14]。本研究中，NSC697923 處理組精子蛋白泛素化水平顯著低于對照組，且有劑量依賴性，說明NSC697923 確實抑制了UPS，與Huang 等[15]的研究結(jié)果一致。

UPS 參與哺乳動物精子獲能已得到證實[16]。Hillman 等[17]研究發(fā)現(xiàn)26S 蛋白酶體降解A 激酶錨定蛋白（AKAP 3），部分調(diào)節(jié)蛋白激酶A（PKA）的釋放，這是通向獲能所必需的步驟。此外，也有研究表明在精子獲能時，可能會發(fā)生頂體內(nèi)和頂體表面相關(guān)蛋白的從頭泛素化和蛋白酶體降解相關(guān)靶蛋白，如精子黏附素（AQN1、AWN1）和頂體酶抑制劑（SPINK2）[11]、DQH 蛋白[16]、乳糖黏附蛋白（MFGE-8、P47）、去整合素和金屬蛋白酶5（ADAM5）和頂體結(jié)合蛋白（ACRBP）[10,18]等。本實驗中，在精子獲能和頂體反應(yīng)后的蛋白泛素化水平明顯上調(diào)的情況下，向獲能液中添加E2 抑制劑NSC697923 抑制UPS 后，檢測精子蛋白p32 酪氨酸磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)僅有對照組在32 ku 處出現(xiàn)蛋白條帶，表明添加NSC697923 后UPS 途徑得到抑制的精子均未獲能。以上結(jié)果表明，獲能確實伴隨著精子蛋白泛素化水平上調(diào)，說明UPS 參與了精子的獲能過程，且必不可少，這與Zigo 等[16]的研究結(jié)果相符。

UPS 在哺乳動物精子發(fā)生和體外受精過程中都具有重要的作用[16,19]。在UPS 參與精子獲能的證據(jù)方面，目前研究最多的是26S 蛋白酶體。添加蛋白酶體抑制劑如MG-132 和環(huán)氧霉素可抑制頂體外膜重塑，改變獲能，防止發(fā)生頂體反應(yīng)，顯著降低體外受精能力[19-20]。此外，還有E1 抑制劑PyR-41 在獲能過程中也改變頂體外膜重構(gòu)，降低獲能能力，在體外受精中防止精子穿透透明帶，降低精子體外受精卵母細(xì)胞的能力[11]。目前已鑒定出更多的精子蛋白酶體/UPS 底物，并揭示了UPS 調(diào)節(jié)的性質(zhì)[5]。但還沒有關(guān)于這些蛋白質(zhì)在獲能過程中是如何被UPS 調(diào)控的確切證據(jù)。本研究中，NSC697923處理組的精卵結(jié)合能力顯著低于對照組，且隨著E2 抑制劑濃度下降，黏附率也隨之下降。說明抑制精子UPS會降低精子體外受精的精卵結(jié)合能力。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，豬獲能精子的蛋白泛素化水平顯著上調(diào)，而在豬精子獲能液中添加E2 抑制劑NSC697923 則能顯著抑制精子獲能，且隨著抑制劑濃度的增加，精子黏附率顯著下降，說明UPS 是豬精子獲能必不可少的環(huán)節(jié)。本研究支持了UPS 在精子獲能中有重要作用這一前人的研究結(jié)果，進(jìn)而提出了將精子蛋白泛素化水平作為檢測精子獲能指標(biāo)的可能性，但精子蛋白質(zhì)泛素化水平能否作為精子獲能的標(biāo)志還有待于進(jìn)一步研究。