基于50K SNP 芯片技術(shù)對金華豬和嵊縣花豬繁殖性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

蔡 薇，羅才玉，項 云，章嘯君，徐寧迎，郭曉令*

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江金華 321017）

繁殖性狀是畜牧生產(chǎn)中最重要的經(jīng)濟性狀之一，母豬的繁殖性狀將直接影響豬肉產(chǎn)量和經(jīng)濟效益[1]。在現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)中，提高總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)是養(yǎng)豬的主要目標(biāo)之一[2]。由于繁殖性狀的遺傳機制較為復(fù)雜，遺傳力較低且表型僅在母豬后期才可體現(xiàn)[1,3]，因此利用傳統(tǒng)育種方法所獲得的遺傳進展十分緩慢。近年來，隨著分子生物技術(shù)和豬高密度SNP 芯片不斷發(fā)展，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）技術(shù)能夠更準(zhǔn)確地定位QTL 區(qū)域及候選基因。從豬的數(shù)量性狀座位（QTL）數(shù)據(jù)庫（https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index）中可以發(fā)現(xiàn)，截至到2019 年8 月，已有657 篇文獻報道了與豬678 個性狀相關(guān)的29 045 個QTLs。迄今為止，已有GWAS 用于豬繁殖性狀分析，如豬的乳頭數(shù)[4]、排卵率[5]、產(chǎn)活仔數(shù)[2]、產(chǎn)死仔數(shù)和木乃伊數(shù)[2,6]。GWAS 結(jié)果發(fā)現(xiàn)17 個影響仔豬活仔數(shù)的SNPs[7]且VRTN被認(rèn)為最可能與乳頭數(shù)相關(guān)的基因[8]。然而目前對地方豬種經(jīng)濟性狀的GWAS 研究較少，因此，本研究利用浙江省地方豬種金華豬和嵊縣花豬群體，測定總產(chǎn)仔數(shù)（TNB）和產(chǎn)活仔數(shù)（NBA），采用豬50K SNP 芯片技術(shù)獲得的基因型對2 個群體進行獨立GWAS 分析及META 分析，探究顯著影響TNB 和NBA 的SNP 位點，為主效基因的定位和選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物采用金華家農(nóng)兩頭烏種豬有限公司及金華市農(nóng)科所的255 頭金華豬，314 頭嵊縣花豬來自紹興市嵊縣花種豬有限公司，2 個群體均是在產(chǎn)母豬，個體飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)相同。

1.2 表型數(shù)據(jù) 2 個群體的2 個繁殖性狀（TNB 和NBA）數(shù)據(jù)來自于金華家農(nóng)兩頭烏種豬有限公司、金華市農(nóng)科所和紹興市嵊縣花種豬有限公司。截止2019 年7 月底，最終收集了實驗動物中205 頭金華豬和174 頭嵊縣花豬TNB 和NBA 的表型數(shù)據(jù)。

1.3 基因分型和質(zhì)量控制 采用豬耳緣靜脈采血的方法采取血液，將血液滴于血斑卡，送至紐勤生物科技（上海）有限公司提取DNA，將質(zhì)檢合格的DNA 樣品利用Illumina 平臺的GGP Porcine50K SNP 芯片進行基因分型。利用PLINK v1.09 軟件對基因型數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，剔除檢出率＜90%、個體基因型缺失率＞0.1、最小等位基因頻率（MAF）＜0.05 以及哈代溫伯格平衡P＜1×10-6的SNPs。

1.4 群體結(jié)構(gòu)分析 在進行GWAS 分析時，群體分層可以導(dǎo)致分析結(jié)果出現(xiàn)假陽性[9]。PCA 方法主要用于遺傳學(xué)的聚類分析，它根據(jù)遺傳差異將個體分為不同的亞組，以探索群體的遺傳結(jié)構(gòu)[10-12]。因此，本研究將此方法應(yīng)用于群體分層分析。本研究利用GCTA 軟件對有效SNP 進行主成分分析（PCA），獲得基因組數(shù)據(jù)特征值和特征向量，并用R 程序做PCA 圖。

1.5 統(tǒng)計分析 本研究采用GEMMA 軟件進行關(guān)聯(lián)分析。GEMMA 是一個用于GWAS 分析的經(jīng)典軟件，混合線性模型（MLM）又能將群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分別作為固定效應(yīng)和隨機效應(yīng)加在關(guān)聯(lián)分析模型中，以此來控制關(guān)聯(lián)分析中的假陽性，因此，本實驗采用MLM 進行關(guān)聯(lián)分析，模型如下：

y=Wα+xβ+μ+ε

其中，y 為對應(yīng)的繁殖性狀表型值，n 個樣本對應(yīng)n 個性狀；W 是固定效應(yīng)矩陣；α是包含截距在內(nèi)的相應(yīng)系數(shù)；x 表示SNP 基因型；β表示標(biāo)記的效應(yīng)大?。沪淌请S機效應(yīng)；ε表示殘差。META 分析時，將豬種的不同作為固定效應(yīng)進行分析。本研究采用Bonferroni 多重檢驗方法確定關(guān)聯(lián)顯性閾值，基因組水平顯著閾值為0.05/有效SNP 位點數(shù)量，染色體水平顯著閾值為1/有效SNP 位點數(shù)量。

1.6 候選基因注釋 根據(jù)GWAS 的結(jié)果，針對顯著SNP位點的名稱和所在基因組位置，通過Ensembl（http://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/info/Index）和NCBI（hppt://www.ncbi.nim.nih.gov/）上的信息，在其上、下游尋找候選基因，并結(jié)合文獻報道對候選基因進行功能注釋。

2 結(jié)果

2.1 表型數(shù)據(jù)分析 如表1 所示，金華豬性狀TNB 的平均值為10.17，NBA 平均值為9.18。嵊縣花豬性狀TNB 平均值為12.35，性狀NBA 的平均值為12.08。META 分析性狀TNB 的平均值為11.17，性狀NBA 的平均值為10.86。

2.2 質(zhì)控后的有效SNP 數(shù) 如表2 所示，質(zhì)控后，金華豬群體得到28 172 個有效SNPs；嵊縣花豬群體得到25 763 個有效SNPs；用于META 分析的金華豬和嵊縣花豬混合群體最終得到23 762 個有效SNPs。

表1 金華豬、嵊縣花豬和META 分析TNB 和NBA 性狀的描述統(tǒng)計

表2 質(zhì)控后有效個體數(shù)和有效SNP 數(shù)量表

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析 如圖1 所示，金華豬和嵊縣花豬群體各自相對集中，可以清楚地分為2 組，這表明金華豬群體內(nèi)以及嵊縣花豬群體內(nèi)不存在明顯的群體分層，而金華豬和嵊縣花豬則被明顯地分為2 個群體。在后續(xù)的META 分析中，將PCA 結(jié)果的前3 列主成分作為協(xié)變量加入關(guān)聯(lián)模型以此校正群體分層的影響。

2.4 GWAS

2.4.1 金華豬GWAS 結(jié)果 如表3 所示，對于TNB，共檢測到11個顯著關(guān)聯(lián)的SNP，有5個SNP達到基因組顯著水平，其中有3 個SNP 位于2 號染色體，2 個SNP 位于14 號染色體，達到染色體水平顯著的6 個SNP 分別位于2、5、6、14 號染色體。這11 個SNP 分別鄰近或座落于

SPINK9、NANOS1、SH3TC2、GRK5、ARHGEF37、PPP2R2B、HOOK1、E2F7基因。對于NBA，共檢測到9 個顯著關(guān)聯(lián)的SNP，發(fā)現(xiàn)8 個SNP 和與TNB 相關(guān)顯著SNP 相同，分別鄰近或座落于NANOS1、SPINK9、SH3TC2、ARHGEF37、PPP2R2B基因，還有1 個SNP位點ASGA0012858位于2號染色體，鄰近于PDE6A基因。

2.4.2 嵊縣花豬GWAS 結(jié)果 在嵊縣花豬群體中，共檢測到1 個與TNB 和NBA 都相關(guān)的SNP（表4），該SNP 位于9 號染色體，鄰近于PHTF2基因。金華豬、嵊縣花豬以及META 分析TNB 和NBA 的GWAS 結(jié)果如圖2 所示。

2.4.3 META 分析GWAS 結(jié)果 在金華豬和嵊縣花豬混合群體中，共鑒別到1 個與TNB 相關(guān)、達到基因組水平顯著的SNP 位點，17 個達到染色體水平顯著的SNP位點（表5）。其中最顯著SNP 位點WU_10.2_14_140199680 的P值為1.58E-10，鄰近于NANOS1基因。另外有14 個SNP 位點位于5 號染色體，這些SNP 鄰近或座落于INTS13、GUCY2C、GRIN2B、FAM234B、BCAT1、AEBP2、HELB、SRGAP1、SLC35E3、KRAS基因。SNP 位點H3GA0016291 和ALGA0031876位于6 號染色體，鄰近于MIIP基因。對于NBA，共鑒別到3 個SNP，其中1 個達到基因組顯著水平的SNP 和TNB 達到顯著的SNP 位點相同，鄰近基因為NANOS1。另外2 個達到染色體水平顯著的SNP 分別位于2 號和5 號染色體，分別鄰近于SPINK9、CRY1基因。金華豬、嵊縣花豬、META 分析TNB 和NBA關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖如圖3～5 所示。

3 討 論

GWAS 是鑒定家畜復(fù)雜性狀的一種有效方法。在豬生產(chǎn)中，GWAS 被用來鑒定與生產(chǎn)相關(guān)性狀的候選基因。本研究對金華豬和嵊縣花豬2 個群體的TNB 和NBA 分別做了獨立GWAS 和META 分析。在GWAS 分析中，采用Bonferroni 校正多重檢驗確定顯著閾值，在金華豬、嵊縣花豬和META 分析群體中，分別檢測到20、2、21個SNP 達到基因組或染色體顯著水平。群體分層會對GWAS 結(jié)果的準(zhǔn)確性造成比較大的影響[13]。本研究群體來自相同的農(nóng)場，遺傳結(jié)構(gòu)較為相似。另外，PCA 圖和QQ 圖都顯示本實驗群體沒有明顯的群體分層，這表示本研究的GWAS 結(jié)果是可靠的。

表3 金華豬TNB 和NBA 顯著關(guān)聯(lián)SNP 位點

表4 嵊縣花豬TNB 和NBA 顯著關(guān)聯(lián)的SNP 位點

表5 META 分析TNB 和NBA 顯著關(guān)聯(lián)SNP 位點

根據(jù)金華豬群體的GWAS 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了5 個基因（SPINK9、NANOS1、SH3TC2、ARHGEF37、PPP2R2B）同時影響TNB 和NBA，分布于2 號和14 號染色體上。其中，SPINK9 是一種Kazal 型絲氨酸蛋白酶抑制劑，在手掌和足底特異性表皮分化中發(fā)揮作用[14]。NANOS1位于14 號染色體，是維持成年斑馬魚卵母細胞生成所必需的基因[15]，也有研究表明，NONOS1-PUMILIO2 復(fù)合物可能調(diào)節(jié)人生殖細胞染色體內(nèi)的mRNA 翻譯[16]。SH3TC2基因的突變可能導(dǎo)致周圍神經(jīng)炎癥[17]。對于ARHGEF37基因的研究目前較少，有文獻表明ARHGEF37 是一種參與內(nèi)吞作用的調(diào)節(jié)蛋白[18]。PPP2R2B 是一種在整個大腦神經(jīng)元中廣泛表達的蛋白質(zhì)，它調(diào)節(jié)微管相關(guān)蛋白tau 和其他底物的蛋白磷酸酶2A（PP2A）活性[19]。位于5 號和6 號染色體的E2F7和HOOK1是僅影響TNB 的候選基因。E2F7屬于E2F 家族成員。大量研究表明，E2F 家族成員具有激活和抑制細胞增殖、凋亡和分化過程中許多必需基因轉(zhuǎn)錄的功能[20]。Li 等[21]研究發(fā)現(xiàn)E2F7 是對控制細胞增殖起重要作用的轉(zhuǎn)錄抑制因子，和E2F8 的協(xié)同功能對細胞存活和胚胎發(fā)育起著重要作用。研究表明，HOOK1 功能的喪失導(dǎo)致精子細胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)異位，并導(dǎo)致產(chǎn)生異常的精子頭部形狀[22]。位于14 號染色體的GRK5基因被認(rèn)為是影響中國漢族人2 型糖尿病的一個候選基因[23]。影響NBA 的候選基因PDE6A的突變引起小鼠隱形視網(wǎng)膜色素變性[24]。

根據(jù)嵊縣花豬GWAS 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SNP 位點MARC 0001353 與TNB 和NBA 都相關(guān)，鄰近基因為PHTF2，PHTF2 主要在肌肉中表達[25]，定位于細胞核并參與DNA 結(jié)合，也可能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起作用。嵊縣花豬群體GWAS 結(jié)果發(fā)現(xiàn)的顯著SNP 位點較少，分析可能是由于以下2 點原因造成：一是嵊縣花豬群體規(guī)模有限，導(dǎo)致表型分離不明顯；二是采用Bonferroni 校正多重檢驗校正得到的顯著水平過于嚴(yán)格，閾值過高，導(dǎo)致達到閾值的SNP 位點較少。

基于2 個群體的META 分析尋找到的候選基因為NANOS1、INTS13、GUCY2C、GRIN2B、MIIP、FAM234B、SPINK9、BCAT1、AEBP2、HELB、SRGAP1、SLC35E3、KRAS、CRY1。其中NANOS1和SPINK9基因在金華豬和嵊縣花豬獨立GWAS 結(jié)果中也是候選基因，根據(jù)GWAS 結(jié)果以及基因注釋，NANOS1很可能是影響TNB 和NBA 的候選基因。新鑒定出的顯著SNP 位點多位于5 號染色體，AEBP2基因是一種已知的PRC2（多細胞生物中可遺傳基因沉默的關(guān)鍵介質(zhì)）輔因子，其在體外已被證明可刺激PRC2 活性。研究表明，AEBP2基因可能間接地影響胚胎發(fā)育[26]。Zhang 等[27]研究發(fā)現(xiàn)位于5 號染色體的SRGAP1基因與豬耳大小有關(guān)?；诨蚬δ茏⑨尳Y(jié)果，其余候選基因多與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及癌癥的發(fā)生有關(guān)。

由于母豬的各繁殖性狀受多個因素的影響，存在種間差異，樣本量也一定程度上影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此不同的品種定位的顯著SNP 位點各有不同。本研究定位的基因?qū)NB 和NBA 是否有影響及如何影響有待進一步探索，為后期的驗證研究提供了新的方向和思路。

4 結(jié) 論

本研究對205 頭金華豬和174 頭嵊縣花豬的TNB和NBA 進行獨立GWAS 和META 分析，金華豬和嵊縣花豬分別鑒定到20、2 個顯著SNP，META 分析鑒定到21 個顯著SNP。共發(fā)現(xiàn)22 個候選基因，通過基因注釋發(fā)現(xiàn)NANOS1、E2F7、AEBP2是最有可能影響TNB 和NBA 的候選基因。