不同冷脅迫方式對(duì)縊蟶無水?；钇诳寡趸富钚约爸|(zhì)過氧化的影響

郝爽，張敏、2、3*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306； 2.上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 201306； 3.上海海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

縊蟶Sinonovaculaconstricta俗稱蟶子，是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝類， 生活于潮間帶中、下區(qū)或潮下帶的淺海沙灘或泥沙灘，濾食水中有機(jī)懸浮物，營(yíng)埋棲生活。縊蟶在中國(guó)北自遼寧、山東，南至廣東、福建都有分布[1]?？O蟶肉鮮嫩可口、營(yíng)養(yǎng)豐富并具有一定的藥物功效，不僅具有高蛋白質(zhì)、低脂肪的優(yōu)點(diǎn)，還富含碘、硒、鋅、錳等多種微量元素，具有健腦益智、清熱解毒的作用[2]。由于中國(guó)生產(chǎn)地域限制，縊蟶在沿海地區(qū)的銷售以鮮活為主，在內(nèi)陸地區(qū)的銷售，只能依靠蟶肉罐頭、蟶干、冷凍蟶肉制品[3]等形式，其食用口感和品質(zhì)大打折扣，并影響縊蟶的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，限制了縊蟶消費(fèi)市場(chǎng)的推廣。縊蟶的采捕時(shí)間相對(duì)集中，蟶肉組織較松軟、微生物較多，捕撈后新鮮度會(huì)很快下降，腐敗變質(zhì)并死亡，給鮮銷儲(chǔ)運(yùn)帶來不便。對(duì)長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)呢?fù)面影響，導(dǎo)致銷售半徑較小、價(jià)格下跌，這在一定程度上制約了縊蟶養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展?？O蟶的低溫?；羁蔀殚L(zhǎng)途運(yùn)輸提供有利條件并能延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，保持其色澤美觀和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此，研究縊蟶的低溫保活具有重要的商業(yè)意義及現(xiàn)實(shí)意義。

在?；顑?chǔ)運(yùn)操作過程中必須注意的關(guān)鍵因素，包括溫度、鹽度、溶氧、pH、氨氮、污染物等。當(dāng)重要的環(huán)境因素發(fā)生變化時(shí)，縊蟶體內(nèi)活性氧代謝及抗氧化系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)會(huì)被顯著影響，導(dǎo)致超氧陰離子等自由基的抑制與產(chǎn)生發(fā)生紊亂，使縊蟶產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。若環(huán)境的變化導(dǎo)致縊蟶長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)就會(huì)使機(jī)體抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆的損傷，影響縊蟶代謝、生長(zhǎng)甚至死亡[4]。劉浩明等[5]研究發(fā)現(xiàn),不同濃度Cu2+脅迫下,96 h內(nèi)縊蟶稚貝抗氧化酶(CAT、SOD)活力與沙濾海水對(duì)照組相比發(fā)生顯著的變化；祁營(yíng)利等[6]對(duì)縊蟶個(gè)體進(jìn)行控溫、控濕、清洗對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明，0 ℃時(shí)?；钚Ч詈?，存活率最高且失重率和開殼率較低，清洗組效果不如帶沙組，控濕組的?；钚Ч炔豢貪窠M更高。在活運(yùn)過程中，溫度作為最重要的環(huán)境因子之一，與縊蟶的抗氧化能力及代謝功能有密切聯(lián)系。在一定溫度范圍內(nèi)，酶的催化反應(yīng)速率隨著溫度的升高而加快，在達(dá)到酶的最適催化溫度下，酶活力達(dá)到最大值，超過酶的最適催化溫度后，酶催化反應(yīng)速度隨著溫度的升高而降低甚至因高溫導(dǎo)致酶失活。溫度的急劇變化能直接影響水生生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)[5]，根本原因就是溫度的改變導(dǎo)致機(jī)體耗氧量增加[7]，造成機(jī)體自由基代謝紊亂，自由基在體內(nèi)大量積累,從而損害機(jī)體細(xì)胞和組織正常的生理機(jī)能和免疫防御能力,進(jìn)而提高對(duì)病原生物的易感性。雖然對(duì)貝類?；钛芯恳阎饾u受到關(guān)注，但目前有關(guān)環(huán)境因素變化對(duì)貝類抗氧化系統(tǒng)影響方面的研究還鮮有報(bào)道。為此，本研究中進(jìn)行了不同冷脅迫方式對(duì)?；钇谥胸愵惪寡趸到y(tǒng)的影響研究，旨在為活體貝類在養(yǎng)殖、運(yùn)輸和銷售過程中的酶活性保持提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用縊蟶于2018年12月購自上海市浦東新區(qū)南匯新城鎮(zhèn)蘆潮港集貿(mào)市場(chǎng)，平均殼長(zhǎng)為59 mm，殼寬為19 mm，體質(zhì)量為(12±0.5)g，共5 kg。選擇有活力、雙殼完整的個(gè)體作為試驗(yàn)對(duì)象。

試驗(yàn)儀器主要有低溫離心機(jī)(H-2050R,湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、恒溫恒濕箱(BPS-100CA,上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、內(nèi)切式勻漿機(jī)(FSH-2A，江蘇金怡儀器科技有限公司)、紫外可見分光光度計(jì)(T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)等。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 首先將海水晶按比例溶解于去離子水中，配制成鹽度為20.0±0.5的人工海水，并利用增氧泵(3 W)在暫養(yǎng)期間持續(xù)充氣，溶氧量>4 mg/L。將5 kg帶有泥沙的縊蟶，用人工海水清洗、除去縊蟶體表泥沙等雜物后將貝體平鋪(一層)浸于存有人工海水的塑料箱(520 mm×350 mm×285 mm)中凈化暫養(yǎng)，貝水質(zhì)量比為1∶5?？O蟶的適宜生長(zhǎng)溫度范圍為15～21 ℃，冬天生長(zhǎng)溫度為 15 ℃，最適宜溫度為21 ℃，本試驗(yàn)中將水溫維持在(20±1)℃，每隔3 h換一次水,暫養(yǎng)時(shí)間12 h。將暫養(yǎng)凈化后的縊蟶從塑料箱中脫水撈出并分為3組，每組100枚，分別平鋪(一層)在覆有吸水海綿的3個(gè)小尺寸塑料箱(400 mm×300 mm×120 mm)中，并將浸足人工海水的雙層紗布覆于貝體之上，為保證箱體內(nèi)濕度，每隔24 h向紗布上噴淋人工海水進(jìn)行補(bǔ)水作業(yè)。

將3組縊蟶放入降溫裝置中，分別采用直接降溫、梯度降溫及線性降溫的冷脅迫方式。其中，梯度降溫的處理方式為調(diào)節(jié)恒溫恒濕箱，從(20.0±0.5)℃開始降溫，以5 ℃/h的速率降至(15.0±0.5)℃，并在此溫度下保持90 min后，再次以5 ℃/h的速率降溫至(10.0±0.5)℃，并在此溫度下保持90 min，最后再以5 ℃/h的速率降溫至(4.0±0.5)℃后，放至4 ℃冷庫中開始無水?；钸^程。線性降溫的處理方式為調(diào)節(jié)恒溫恒濕箱，以5 ℃/h的降溫速率從(20.0±0.5)℃降至(4.0±0.5)℃后，放至4 ℃冷庫中開始無水?；钸^程。直接降溫的處理方式為直接將縊蟶放至4 ℃的冷庫中，開始無水?；钸^程。其中，梯度降溫和線性降溫方式的冷脅迫時(shí)間皆為3 h。

根據(jù)以往試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，無水?；畹?天的縊蟶成活率已低于50%，繼續(xù)測(cè)量各指標(biāo)已無現(xiàn)實(shí)意義，故本試驗(yàn)中測(cè)試時(shí)間截止到?；畹?天。

1.2.2 組織樣品采集及粗酶提取液制備 試驗(yàn)在降溫前、?；畹?、2、4、6、8天的時(shí)間點(diǎn)上分別取樣，每組隨機(jī)取9只,取其組織塊在冰冷的生理鹽水中漂洗，分別取出消化腺和鰓組織作為混合樣品，用吸水紙拭干表面水分，用精量天平稱重后，放入勻漿管中。按樣品質(zhì)量與體積為1∶9(g∶mL)的比例加入0.86%的生理鹽水于勻漿管中，冰浴條件下勻漿，轉(zhuǎn)速為7000～8000 r/min，10 s/次，間隙30 s，連續(xù)3～5次。將制備好的10%勻漿液用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)(7000 r/min)離心20 min，取上清液用于酶活力測(cè)定。

1.2.3 抗氧化酶活力的測(cè)定 取混合樣品上清液用于測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性，以及還原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)含量。樣品上清液總蛋白含量的測(cè)定采用BCA法，CAT測(cè)定采用紫外比色法，SOD測(cè)定采用羥胺法，MDA測(cè)定采用TBA法，POD測(cè)定采用比色法，H2O2和GSH測(cè)定采用分光光度法。均使用南京建成生物工程研究所試劑盒，測(cè)定原理、試驗(yàn)步驟和計(jì)算方法均參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及Duncan多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷脅迫處理組CAT和SOD酶活力的變化

從圖1-A可見：不同冷脅迫組縊蟶消化腺和鰓組織混合樣中的CAT活力隨?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)；相比降溫前，直接、梯度和線性降溫組的CAT活力在降溫后第0天分別增加12.9%、23.7%、20.7%；梯度降溫組和線性降溫組在?；畹?天時(shí)達(dá)到峰值，分別為12.99、15.05 U/mg，較降溫前CAT活力增加76%、104%，第8天時(shí)分別下降到10.67、13.09 U/mg；直接降溫組的CAT活力在第6、8天時(shí)顯著高于其他兩組(P<0.05),并在第8天時(shí)，CAT活力達(dá)到最大，為20.57 U/mg，分別較梯度降溫組和線性降溫組增加92%和57%；在保活期內(nèi)，梯度降溫組和線性降溫組的CAT活力無顯著性差異(P>0.05)。

從圖1-B可見：不同冷脅迫組縊蟶的SOD活力在降溫后隨保活時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈波動(dòng)上升趨勢(shì)；相比降溫前，直接、梯度和線性降溫組的SOD活力在降溫后第0天分別增加46.9%、36.4%和43.9%；在?；畹?天時(shí)，直接降溫組、梯度降溫組和線性降溫組的SOD活力均達(dá)到最大，分別為42.01、38.13、38.81 U/mg，直接降溫組在?；畹?天時(shí)SOD活力顯著高于其他兩組(P<0.05)；在?；钇趦?nèi)，線性降溫組和梯度降溫組的SOD活力無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 不同冷脅迫處理組MDA和POD含量的變化

從圖2-A可見：直接降溫組縊蟶的MDA含量隨?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)總體呈上升趨勢(shì);梯度降溫組和線性降溫組在?；?～4 d時(shí)，MDA含量與降溫前相比變化并不明顯，其中?；畹?天，梯度和線性降溫組的MDA含量較降溫前僅增長(zhǎng)了5.1%和10.6%；直接降溫組、梯度降溫組和線性降溫組的MDA含量在?；畹?天時(shí)均達(dá)到最高值,分別為14.73、11.80、10.93 nmol/mg;直接降溫組在保活第2、4天時(shí)的MDA含量顯著高于其他兩組(P<0.05)；在保活期內(nèi)，梯度降溫組與線性降溫組的MDA含量變化并無顯著性差異(P>0.05)。

注：標(biāo)有不同字母者表示同一時(shí)間下不同處理組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同Note: The means with different letters at same time are significantly different in the different groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia圖1 不同冷脅迫方式下CAT和SOD酶活力的變化Fig.1 Catalase(CAT) and superoxide dismutase(SOD) activities in zazor clam under different cold acclimation methods

從圖2-B可見：不同冷脅迫組縊蟶的POD活力在降溫后第0天時(shí)明顯上升，直接降溫組、梯度降溫組和線性降溫組POD活力分別達(dá)到16.45、12.00、14.14 U/mg,分別較降溫前增加117%、58%、86%；在?；畹?、4天時(shí)各組POD活力呈下降趨勢(shì)，在第4天時(shí)達(dá)到最低值，直接降溫組、梯度降溫組和線性降溫組的POD活力分別為12.79、8.00、8.39 U/mg，其中梯度降溫組和線性降溫組的POD活力降至降溫前水平；之后POD活力逐漸上升，在?；畹?天時(shí)，直接降溫組和梯度降溫組的POD活性達(dá)到峰值18.59、13.76 U/mg；直接降溫組在4～8 d?；钇趦?nèi)POD活力均顯著高于其他兩組(P<0.05)；在?；钇趦?nèi)，梯度降溫組和線性降溫組POD活性無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 不同冷脅迫方式下MDA含量和POD酶活力的變化Fig.2 Malondialdehyde (MDA) content and peroxidase (POD) activities in zazor clam under different cold acclimation methods

2.3 不同冷脅迫處理組GSH和H2O2含量的變化

從圖3-A可見：直接降溫組、梯度降溫組和線性降溫組縊蟶的GSH含量在?；畹?、2天時(shí)有明顯上升趨勢(shì)，相比降溫前，直接和線性降溫組的GSH含量在降溫后第0天時(shí)分別增加25.1%和9.3%，但梯度降溫組卻下降了7.2%，在第2天時(shí)各組GSH含量均達(dá)到峰值，分別為16.74、14.83、14.34 mg/g；在?；畹?～8天時(shí)，各組GSH活性逐漸下降，保活第8天時(shí)，直接降溫組、梯度降溫組和線性降溫組的GSH含量分別為8.23、8.91、8.31 mg/g，均低于降溫前水平；直接降溫組在?；畹?天時(shí)的GSH含量顯著高于其他兩組(P<0.05)；在?；钇趦?nèi)，梯度降溫組和線性降溫組的GSH活性并無顯著性差異(P>0.05)。

從圖3-B 可見：?；钇趦?nèi)不同冷脅迫組縊蟶H2O2含量均呈波動(dòng)變化趨勢(shì)；降溫后第0天時(shí)，直接降溫組的H2O2含量增加18.1%，梯度降溫組變化不明顯，線性降溫組則有5.7%的下降；各組H2O2含量在?；畹?天時(shí)均達(dá)到峰值，并在?；畹?天后逐漸下降至降溫前水平；梯度降溫組和線性降溫組的H2O2含量在?；钋捌趦?nèi)相差不明顯，但在保活第4、6、8天時(shí)，兩組H2O2含量有顯著性差異(P<0.05)；直接降溫組的H2O2含量在?；畹?、4、8天時(shí)顯著高于其他兩組(P<0.05)。

圖3 不同冷脅迫方式下GSH和過氧化氫含量的變化Fig.3 Reduced glutathione (GSH) and Hydrogen peroxide (H2O2) contents in zazor clam under different cold acclimation methods

3 討論

3.1 不同冷脅迫方式對(duì)無水保活期中縊蟶SOD酶活力的影響

3.2 不同冷脅迫方式對(duì)無水?；钇谥锌O蟶CAT酶活力的影響

3.3 不同冷脅迫方式對(duì)無水?；钇谥锌O蟶POD酶活力的影響

3.4 不同冷脅迫方式對(duì)無水?；钇谥锌O蟶GSH含量的影響

3.5 不同冷脅迫方式對(duì)無水?；钇谥锌O蟶MDA含量的影響

丙二醛(MDA)是細(xì)胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，MDA含量多少可間接反映機(jī)體受到自由基損傷的程度[21]。當(dāng)生物受到逆境脅迫時(shí),能促使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)線粒體、微粒體和胞漿酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)反應(yīng),通過還原產(chǎn)生過量的氧自由基及中間物質(zhì),使生物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)失衡,導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[22-23]。本研究中，在無水?；钇趦?nèi)，各組縊蟶的MDA含量隨?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)均呈上升趨勢(shì)，并以直接降溫組的MDA含量增長(zhǎng)尤其顯著，?；畹?天時(shí)的MDA含量較降溫前增加了117%，且均高于梯度降溫組和線性降溫組。MDA含量的持續(xù)上升說明機(jī)體的抗氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)并沒有恢復(fù)，持續(xù)的低溫脅迫導(dǎo)致活性氧代謝朝著更不利的方向進(jìn)行，且恢復(fù)時(shí)間可能與應(yīng)激反應(yīng)時(shí)間有關(guān)，同時(shí)也說明了直接降溫的冷脅迫方式加速了損傷程度，不利于抗氧化系統(tǒng)平衡態(tài)的恢復(fù)。洪美玲等[24]同樣研究發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹在經(jīng)歷高溫脅迫和低溫脅迫下后其MDA含量基本呈上升趨勢(shì)，由此判斷，中華絨螯蟹經(jīng)受溫度脅迫后均因自由基產(chǎn)生了一定損傷，并隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)氧化損傷持續(xù)加劇。

3.6 不同冷脅迫方式對(duì)無水保活期中縊蟶過氧化氫含量的影響

4 結(jié)論

(1)縊蟶在分別采用不同的冷脅迫方式進(jìn)入無水?；顮顟B(tài)后，相較于直接降溫的?；钋疤幚矸绞剑荻群途€性降溫對(duì)縊蟶在?；钇趦?nèi)的SOD、CAT、POD等抗氧化酶活力及脂質(zhì)過氧化狀態(tài)影響較小，并表現(xiàn)出明顯的差異性，緩解了低溫脅迫狀態(tài)下縊蟶的氧化應(yīng)激，有利于縊蟶機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)恢復(fù)平衡狀態(tài)，因此，縊蟶低溫脅迫過程中應(yīng)盡量避免溫度驟降帶來的危害，嚴(yán)格控制溫降速率，脅迫時(shí)降溫速率不應(yīng)超過5 ℃/h。

(2)SOD、CAT和MDA等指標(biāo)在低溫下隨保活時(shí)間的變化上升趨勢(shì)明顯，與降溫前相比差異顯著，這些指標(biāo)可以作為縊蟶對(duì)冷脅迫檢測(cè)的指標(biāo)。