基于HPLC 指紋圖譜的滇重樓野生品與移栽品鑒別和化學(xué)模式識別研究

王騫，江林蔓，周濃，母茂君，楊敏

1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120

滇重樓Paris polyphyllavar.yunnanensis為重樓藥材的來源植物之一，主產(chǎn)于云南、貴州和四川等省區(qū)[1]。重樓廣泛用于中藥配方及中成藥原料，由于市場需求量較大，野生滇重樓被過度采挖，導(dǎo)致野生資源匱乏。野生滇重樓根莖生長緩慢，從種子萌發(fā)到可采摘入藥需10 年左右。滇重樓已被列為云南省30 種稀缺瀕危天然藥物之一。目前市場流通的滇重樓以栽培品為主，其種源主要來自野生混雜群體，種質(zhì)資源缺乏，難以保證品質(zhì)[2]。又滇重樓種苗繁育技術(shù)難度較大，生長周期長[3]，培育高品質(zhì)滇重樓已成為亟待解決的問題。宋九華等[4]對野生與栽培重樓藥材的重樓皂苷和無機元素含量進行比較分析，發(fā)現(xiàn)野生品鈣、鎂、鐵、錳、鋅、銅含量高于栽培品，而栽培品的重樓皂苷Ⅰ含量高于野生品。鄒亮等[5]對6 個不同產(chǎn)地的野生與栽培滇重樓進行品質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)野生品的重樓皂苷含量低于栽培品。李海濤等[6]對來自不同產(chǎn)地的野生與栽培滇重樓進行研究，發(fā)現(xiàn)栽培環(huán)境接近野生環(huán)境的栽培品皂苷含量較高。迄今尚未見不同自然分布區(qū)、引種馴化（野生變家種的移栽品）種植基地滇重樓品質(zhì)差異的系統(tǒng)研究，是滇重樓入藥品質(zhì)研究的薄弱環(huán)節(jié)。

中藥指紋圖譜基于對中藥物質(zhì)群整體作用的認識，借助光譜和色譜等手段獲得藥物特征圖譜，可用于鑒別中藥真?zhèn)渭霸u價其質(zhì)量一致性。中藥指紋圖譜可同時反映中藥中多種成分的含量情況，對全面控制其質(zhì)量尤為重要。本研究收集22 份不同產(chǎn)地的野生與移栽滇重樓，建立滇重樓的HPLC 指紋圖譜，并對其進行化學(xué)模式識別研究，為全面控制滇重樓品質(zhì)提供參考。

1 儀器與試藥

1100 LC 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）、ML204 型分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

重樓皂苷Ⅰ對照品（批號111590-201604，純度93.6%）、重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?11591-201604，純度91.4%）、重樓皂苷Ⅵ對照品（批號111592-201604，純度97.0%）、重樓皂苷Ⅶ對照品（批號111593-201604，純度94.0%），中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用。乙醇、石油醚、正丁醇均為分析純（成都科龍化學(xué)試劑），甲醇和乙腈為色譜純（德國默克），水為娃哈哈純凈水。

新鮮的野生及移栽滇重樓于2016 年7－8 月采集于貴州、云南、四川的典型分布區(qū)（見表1），經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥學(xué)教研室張德全副教授鑒定為百合科植物云南重樓P. polyphyllavar.yunnanensis，憑證植物標(biāo)本及藥材標(biāo)本均保存于三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室（重慶三峽學(xué)院）。根莖洗凈后45 ℃烘干至恒重，密封4 ℃貯存，用于品質(zhì)分析。

表1 不同產(chǎn)地滇重樓樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

分別精密稱取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品各4 mg，加10 mL 甲醇溶解，制成0.4 mg/mL 的對照品貯備溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取樣品1.0 g，置圓底燒瓶，加入75%乙醇30 mL，回流提取2 次，第1 次回流提取1.5 h，第2 次回流提取1 h，合并提取液，減壓蒸干，加20 mL水溶解。用石油醚萃取5 次，每次20 mL，石油醚層棄去。再用正丁醇萃取3 次，每次20 mL。合并正丁醇層萃取液，減壓蒸干，用甲醇-乙腈（1∶1）溶解，定容至10 mL 容量瓶中，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:Agela Venusil XBP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相:乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～11 min，80%～75%B；11～14 min，75%～72%B；14～24 min，72%～68%B；24～34 min，68%～62%B；34～43 min，62%～58%B；43～52 min，58%～54%B；52～58 min，54%～48%B；58～73 min，48%～36%B；73～83 min，36 %～29%B；83～93 min，29%～24%B；93～100 min，24 %～14 % B；100～120 min，14%B）；檢測波長:210 nm；柱溫:35 ℃；流速:1.0 mL/min；進樣量:10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗

按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件，將供試品溶液連續(xù)進樣6 次，結(jié)果11個共有峰的相對保留時間及相對峰面積RSD 均小于3%，表明該方法的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液（Y1），分別于0、2、4、8、12、24 h 進行HPLC 分析，結(jié)果11 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗按“2.2”項下方法制備6 份供試品溶液（Y1），進行HPLC 分析，結(jié)果11 個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜構(gòu)建及共有峰確定

各樣品HPLC 指紋圖譜的測定參照周濃等[7]的方法并稍加改進。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 版），以野生品Y1 的圖譜為參照，生成HPLC 共有模式圖譜（見圖1），并計算相似度（見表2）?？梢钥闯觯?2 份樣品共有11 個共有峰，相似度為0.77～0.96，表明22 份滇重樓樣品成分基本相似。同時，野生品與移栽品具有良好的相似度，其值均為0.83，表明野生與移栽重樓整體成分類似，但成分含量存在一定差異。其中，峰6、峰8、峰10 分別為重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅰ。以峰10（重樓皂苷Ⅰ）為參考峰，11 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積見表3、表4。相對保留時間RSD 為0.04%～2.29%，相對峰面積RSD 為64.91%～152.89%。相對峰面積RSD 較大，表明滇重樓藥材指紋圖譜中主要峰群的整體面貌基本一致，但成分含量有較大差異，進一步說明不同產(chǎn)地的滇重樓成分含量不同。

圖1 22 份滇重樓樣品HPLC 指紋圖譜疊加圖

表2 22 份滇重樓樣品指紋圖譜相似度（r）

表3 滇重樓樣品指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表4 滇重樓樣品指紋圖譜共有峰的相對峰面積