控制桃果實(shí)采后病害拮抗酵母的篩選及其固體制劑的制備

張曉云,閆雪莉,吳 鋒,顧香玉,趙利娜,張世濤,張紅印,*

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212004;3.江蘇益群農(nóng)業(yè)科技有限公司,江蘇 新沂 221400)

桃甜美多汁、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,但在貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中極易受到病原菌侵染而發(fā)生病害。由匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)引起的軟腐病是桃果實(shí)采后主要病害之一,發(fā)病的果實(shí)會(huì)喪失可食用性,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。因此必須采取有效的措施控制桃果實(shí)采后病害。傳統(tǒng)的物理控制法存在對(duì)設(shè)備要求較高、影響果蔬品質(zhì)等缺點(diǎn),而化學(xué)控制法易引起病原菌抗性、殘留的化學(xué)殺菌劑對(duì)消費(fèi)者健康造成危害等[2-3]。近年來(lái),利用拮抗微生物控制果蔬采后病害逐漸成為研究的熱點(diǎn),并有望成為替代化學(xué)殺菌劑的新方法[4-5]。其中拮抗酵母因其自身諸多優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的關(guān)注[6]。因此利用拮抗酵母控制桃果實(shí)采后病害具有廣闊的應(yīng)用前景。

拮抗酵母制劑化是其實(shí)際應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。但目前,我國(guó)無(wú)商品化的拮抗酵母制劑,國(guó)際上也只有少數(shù)幾種拮抗酵母制劑產(chǎn)品上市。雖然拮抗酵母液體制劑的制備相對(duì)簡(jiǎn)單,但其運(yùn)輸和保存較為困難,因此制備拮抗酵母的固體制劑對(duì)其應(yīng)用尤為重要。噴霧干燥法是一種將溶液、乳液或懸浮液快速干燥成固態(tài)產(chǎn)品的方法,具有干燥速率快、時(shí)間短(一般為15～40 s)、工藝簡(jiǎn)單和可連續(xù)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。與其他干燥方式如低溫冷凍干燥法相比,噴霧干燥法具有更高的干燥效率和更快的干燥速率,干燥的產(chǎn)品脫水徹底、質(zhì)量輕、便于運(yùn)輸和貯藏,且低溫冷凍干燥費(fèi)用比噴霧干燥高6～10 倍[9]。噴霧干燥過(guò)程中,可以利用保護(hù)劑包覆活性微生物(如酵母菌、乳酸菌等),使微生物本體與外界環(huán)境隔離,增強(qiáng)其抵抗氧、熱等不良刺激的能力,從而提高微生物的存活率[10],所制備的固體制劑一般能在低溫或常溫條件下保存較長(zhǎng)時(shí)間[11]。

本研究從實(shí)驗(yàn)室分離保存的4 株酵母菌中篩選對(duì)桃果實(shí)采后軟腐病具有控制作用的拮抗酵母菌,進(jìn)一步考察拮抗酵母對(duì)桃果實(shí)自然腐爛的控制效果及其對(duì)桃果實(shí)品質(zhì)的影響;然后通過(guò)單因素試驗(yàn)考察噴霧干燥過(guò)程中所用保護(hù)劑種類、阿拉伯膠和海藻糖比、保護(hù)劑質(zhì)量濃度、霧化壓強(qiáng)、進(jìn)風(fēng)溫度和進(jìn)料速率對(duì)固體制劑中拮抗酵母活菌數(shù)的影響,從而優(yōu)化噴霧干燥的條件,并測(cè)定所制備的固體制劑在25 ℃和4 ℃保存過(guò)程中拮抗酵母的存活率以及保存90 d的固體制劑對(duì)桃果實(shí)采后軟腐病的控制效果,為制備可用于控制桃果實(shí)采后病害的拮抗酵母制劑提供參考,對(duì)加快拮抗酵母的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)程具有促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用白鳳水蜜桃(Prunus persica (L.) Batsch cv.Baifeng)采摘于江蘇省鎮(zhèn)江市有機(jī)果園中桃樹向陽(yáng)部位,挑選外觀良好、大小均一、無(wú)器械損傷、果實(shí)表面粉紅色、八成熟的桃果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料。果實(shí)用清水沖洗后,以體積分?jǐn)?shù)0.2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min,再次沖洗,自然晾干后備用。

阿拉伯膠、麥芽糊精、β-環(huán)糊精均為分析純;海藻糖、酪蛋白酸鈉、脫脂乳粉均為食品級(jí)。

NYDA培養(yǎng)基:酵母浸膏5 g,牛肉浸膏8 g,葡萄糖10 g,瓊脂15 g,溶于1 000 mL水;NYDB培養(yǎng)基:NYDA培養(yǎng)基不加瓊脂;PDA培養(yǎng)基:稱取切碎的馬鈴薯200 g于適量水中煮沸20 min,8 層紗布過(guò)濾,濾液加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂粉,加水至1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;大型噴霧干燥機(jī) 常州市魯騰公司;恒流蠕動(dòng)泵 常州維西爾公司;5810R多功能臺(tái)式離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司;生物顯微鏡 麥克奧迪公司;HYL-C3組合式搖床 太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 酵母懸浮液的制備

1.3.1.1 新鮮酵母懸浮液

實(shí)驗(yàn)室分離的酵母菌Pichia occidentalis、Debaryomyces hansenii、P. anomala、P. membranaefaciens于NYDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2 d。分別挑取2 環(huán)于裝有50 mL NYDB培養(yǎng)基的三角瓶(250 mL)中,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)20 h;培養(yǎng)液于8 000 r/min離心15 min,棄上清液。沉淀以無(wú)菌生理鹽水洗滌2 次并重懸,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)至濃度為1×108cells/mL備用。

1.3.1.2 固體制劑懸浮液

稱取適量經(jīng)噴霧干燥獲得的固體制劑,于50 mL 0.85%生理鹽水中,28 ℃、180 r/min振蕩至均勻懸浮,血球板計(jì)數(shù)并調(diào)整酵母濃度至1×108cells/mL。

1.3.2 病原菌孢子懸浮液的制備

R. stolonifer分離于自然腐爛的桃果實(shí),接種至PDA培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)5～7 d后,挑取適量孢子于10 mL離心管中,振蕩混勻,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度至5×104spores/mL。

1.3.3 酵母菌對(duì)桃果實(shí)采后軟腐病的抑制

用無(wú)菌打孔器在桃果實(shí)腰部等距離刺出3 個(gè)傷口(5 mm深、3 mm寬),每個(gè)傷口加入30 μL新鮮酵母懸浮液,以等體積的無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照。2 h后在傷口處加入30 μLR. stolonifer孢子懸浮液,待桃果實(shí)放置2 h后擺放至己消毒的塑料筐(47 cm×35 cm×12 cm)內(nèi),保鮮膜密封,貯藏于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)(20 ℃、相對(duì)濕度95%),分別于第60小時(shí)和第72小時(shí)記錄果實(shí)腐爛直徑和發(fā)病果實(shí)數(shù)目,并計(jì)算果實(shí)腐爛率。每個(gè)處理包含12 個(gè)果實(shí),3 次重復(fù)。腐爛率的計(jì)算式如下:

1.3.4 酵母菌對(duì)桃果實(shí)采后品質(zhì)影響及自然腐爛抑制

采摘的桃果實(shí)當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,對(duì)果實(shí)逐一噴灑新鮮P. membranaefaciens懸浮液,以覆蓋整個(gè)果實(shí)表面為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)照組(CK)噴灑相同體積的無(wú)菌生理鹽水。噴灑后的果實(shí)置于消毒塑料筐內(nèi),室溫放置2 h,然后轉(zhuǎn)移至恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)(20 ℃、相對(duì)濕度95%),貯藏8 d后,計(jì)算桃果實(shí)的自然腐爛率及測(cè)定品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)。每個(gè)處理3 個(gè)平行,每個(gè)平行12 個(gè)桃果實(shí),實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。

桃果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定方法如下:硬度參考邵秀芝等[12]的方法,采用TA-XT質(zhì)構(gòu)分析儀對(duì)桃果實(shí)果實(shí)的硬度進(jìn)行測(cè)定;可溶性固形物采用手持式糖度計(jì)進(jìn)行測(cè)定[13];可滴定酸度采用酸堿滴定法[14],測(cè)定結(jié)果以酒石酸百分比表示,每個(gè)處理重復(fù)4 次;VC含量采用氫氧化鈉滴定法[14],每個(gè)處理重復(fù)4 次。

桃果實(shí)質(zhì)量損失率和自然腐爛率按式(2)、(3)計(jì)算:

1.3.5P. membranaefaciens固體制劑的制備

1.3.5.1 噴霧干燥流程

將離心收集的菌體與保護(hù)劑溶液混合,使菌體質(zhì)量濃度達(dá)到50 g/L,28 ℃、180 r/min振蕩混勻45 min。設(shè)置噴霧干燥機(jī)參數(shù),待出風(fēng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí),打開空氣壓縮機(jī),調(diào)整蠕動(dòng)泵進(jìn)料速率后開始進(jìn)行噴霧干燥,結(jié)束后測(cè)定所得固體制劑中酵母活菌數(shù)并換算成對(duì)數(shù)值。進(jìn)料前及結(jié)束后分別用適量無(wú)菌水進(jìn)樣,以沖洗干燥機(jī)內(nèi)殘?jiān)?/p>

1.3.5.2 保護(hù)劑的篩選

根據(jù)表1,分別稱取一定量的阿拉伯膠、脫脂乳粉和酪蛋白酸鈉于裝有適量0.85%生理鹽水的三角瓶中,50 ℃水浴攪拌至完全溶解,再等比例加入其他保護(hù)劑,制備總質(zhì)量濃度為100 g/L的保護(hù)劑溶液。然后按照1.3.5.1節(jié)方法進(jìn)行噴霧干燥,以每克干粉中活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值作為指標(biāo)選取合適的保護(hù)劑。

表1 保護(hù)劑種類的篩選Table 1 Screening of protectants

1.3.5.3 阿拉伯膠與海藻糖比對(duì)固體制劑中活菌數(shù)的影響

按照1.3.5.2節(jié)的方法,分別制備阿拉伯膠與海藻糖質(zhì)量比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3的保護(hù)劑溶液。在霧化器壓強(qiáng)200 kPa、進(jìn)風(fēng)溫度120 ℃、進(jìn)料速率20 mL/min條件下,按1.3.5.1節(jié)方法進(jìn)行噴霧干燥。

1.3.5.4 保護(hù)劑質(zhì)量濃度對(duì)固體制劑中活菌數(shù)的影響

按1.3.5.2節(jié)的方法分別制備總質(zhì)量濃度為60、80、100、120、140 g/L的阿拉伯膠與海藻糖(1∶1)溶液。在霧化器壓強(qiáng)200 kPa、進(jìn)風(fēng)溫度120 ℃、進(jìn)料速率20 mL/min條件下,按1.3.5.1節(jié)方法進(jìn)行噴霧干燥。

1.3.5.5 霧化器壓強(qiáng)對(duì)固體制劑中活菌數(shù)的影響

按1.3.5.2節(jié)的方法制備總質(zhì)量濃度為100 g/L的阿拉伯膠與海藻糖(1∶1)溶液,設(shè)置噴霧干燥機(jī)霧化器壓強(qiáng)分別為100、150、200、250、300 kPa,進(jìn)風(fēng)溫度為120 ℃、進(jìn)料速率為20 mL/min,按照1.3.5.1節(jié)方法進(jìn)行噴霧干燥。

1.3.5.6 進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)固體制劑中活菌數(shù)的影響

按1.3.5.2節(jié)的方法制備總質(zhì)量濃度為100 g/L的阿拉伯膠與海藻糖(1∶1)溶液,設(shè)置噴霧干燥機(jī)進(jìn)風(fēng)溫度分別為90、100、110、120、130 ℃,霧化器壓強(qiáng)為200 kPa,進(jìn)料速率為20 mL/min,按1.3.5.1節(jié)方法進(jìn)行噴霧干燥。

1.3.5.7 進(jìn)料速率對(duì)固體制劑中活菌數(shù)的影響

按1.3.5.2節(jié)的方法制備總質(zhì)量濃度為100 g/L的阿拉伯膠與海藻糖(1∶1)溶液,將蠕動(dòng)泵進(jìn)料速率分別設(shè)置為10、15、20、25、30 mL/min,進(jìn)風(fēng)溫度為100 ℃、霧化器壓強(qiáng)為200 kPa,按1.3.5.1節(jié)方法進(jìn)行噴霧干燥。

1.3.6 固體制劑相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.6.1 活菌數(shù)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1 g噴霧干燥獲得的固體制劑,溶于50 mL無(wú)菌0.85%生理鹽水中,28 ℃、180 r/min振蕩至均勻懸浮,梯度稀釋后,分別吸取各梯度稀釋液100 μL均勻涂布于NYDA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)2 d,計(jì)數(shù)活菌數(shù)并換算成lg(CFU/g)固體制劑。

1.3.6.2 水分含量的測(cè)定

稱取3 g左右噴霧干燥獲得的固體制劑于干燥至質(zhì)量恒定的鋁制稱量盤中,在105 ℃烘箱內(nèi)干燥至質(zhì)量恒定(前后2 次稱質(zhì)量誤差小于2 mg)后立即轉(zhuǎn)移至干燥器內(nèi),待溫度降至室溫后稱質(zhì)量[13]。每個(gè)處理3 次平行,實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。水分含量按下式計(jì)算:

式中:ma為空稱量盤質(zhì)量/g;mb為干燥前稱量盤和干粉的總質(zhì)量/g;mc為干燥后稱量盤和干粉的總質(zhì)量/g。

1.3.6.3 保存期間酵母菌存活率的測(cè)定

固體制劑置于無(wú)菌、干燥的50 mL離心管中,分別于25 ℃和4 ℃條件下密封保存。每30 d取樣測(cè)定活菌數(shù),計(jì)算固體制劑中的酵母存活率。每個(gè)處理3 次平行,實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。酵母菌存活率按下式計(jì)算:

式中:C1為保存一定時(shí)間的單位固體制劑的活菌數(shù)/CFU;C2為保存前單位固體制劑的初始活菌數(shù)/CFU。

1.3.7 固體制劑對(duì)桃果實(shí)軟腐病的控制效果

按1.3.3節(jié)處理桃果實(shí),傷口處分別接種30 μL新鮮制備的酵母懸浮液、于25 ℃以及4 ℃條件下保存90 d的固體制劑懸浮液,并以等體積的無(wú)菌生理鹽水和保護(hù)劑溶液代替拮抗酵母懸浮液分別作為陰性(CK)和陽(yáng)性對(duì)照,其他操作同1.3.3節(jié)。3 d后統(tǒng)計(jì)腐爛率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不低于3 個(gè)時(shí),采用ANOVA進(jìn)行方差分析,Duncan多重比較進(jìn)行差異分析,P＜0.05,差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗酵母的篩選

拮抗酵母對(duì)水果采后病害的控制效果與其在水果上與病原菌競(jìng)爭(zhēng)空間和營(yíng)養(yǎng)的能力、對(duì)病原菌上的直接寄生作用、對(duì)宿主抗病性的誘導(dǎo)能力等相關(guān)[15],因此不同拮抗酵母對(duì)果蔬水果采后病害的控制效果不同。秦國(guó)政等[16]利用P. membranaefaciensHansen控制“綠化3號(hào)”桃果實(shí)軟腐病,在桃果實(shí)傷口處接種酵母菌懸浮液4 h后,再接種較低量R. stolonifer孢子懸浮液(15 μL,5×104spores/mL),72 h后桃果實(shí)腐爛率近20%,顯著低于對(duì)照(約為60%)。而林麗等[17]在“大久?！碧夜麑?shí)傷口處接種Cryptococcus laurentii懸浮液4 h后,再接種低量R. stolonifer孢子懸浮液(20 μL,1×104spores/mL),7 d后桃果實(shí)腐爛率(23.3%)顯著低于對(duì)照(93.3%)。本實(shí)驗(yàn)中,將4 株酵母菌接種在白鳳水蜜桃傷口處2 h后,再接種較高量R. stolonifer孢子懸浮液(30 μL,5×104spores/mL),桃果實(shí)的腐爛率和腐爛直徑如圖1、2所示。由圖1可知,60 h后,P. occidentalis和D. hansenii處理的桃果實(shí)腐爛率與對(duì)照組(71.31%)沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05),而P. anomala和P. membranaefaciens處理的桃果實(shí)腐爛率顯著低于對(duì)照組,尤其是P. membranaefaciens處理的桃果實(shí)腐爛率僅為20.10%。72 h后,4 株酵母菌處理的桃果實(shí)腐爛率均顯著低于對(duì)照組(95.70%),其中P. membranaefaciens處理的桃果實(shí)腐爛率仍然最低(26.23%)。從圖2可以看出,4 株酵母菌處理對(duì)桃果實(shí)腐爛直徑的影響結(jié)果與腐爛率相似。因此,后續(xù)以菌株P(guān). membranaefaciens作為研究對(duì)象,開展進(jìn)一步的研究。

圖1 4 株酵母菌對(duì)桃果實(shí)軟腐病腐爛率的影響Fig. 1 Effect of four yeast strains on the decay incidence of peaches caused by Rhizopus rot

圖2 4 株酵母菌對(duì)桃果實(shí)軟腐病腐爛直徑的影響Fig. 2 Effect of four yeast strains on the lesion diameter of peaches caused by Rhizopus rot

2.2 新鮮P. membranaefaciens懸浮液對(duì)桃果實(shí)采后自然腐爛及貯藏品質(zhì)的影響

由表2可以看出,在20 ℃條件下貯藏8 d,相比于對(duì)照組,酵母處理的桃果實(shí)自然腐爛率顯著降低(P＜0.05),且品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)(如質(zhì)量損失率、硬度和可溶性固形物等)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。該結(jié)果表明,P. membranaefaciens能顯著抑制采后桃果實(shí)的自然腐爛,并對(duì)桃果實(shí)的品質(zhì)無(wú)顯著不良影響。

表2 新鮮P. membranaefaciens懸浮液對(duì)桃果實(shí)采后自然腐爛率和品質(zhì)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of fresh P. membranaefaciens suspension on natural decay incidence and quality indicators of peach fruit

2.3 P. membranaefaciens固體制劑的制備

2.3.1 保護(hù)劑的篩選

噴霧干燥過(guò)程中,選擇適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑可降低噴霧干燥對(duì)菌體的損害,提高酵母菌存活率[18]。如圖3所示,在第1組實(shí)驗(yàn)中,阿拉伯膠單獨(dú)作為保護(hù)劑,制劑中P. membranaefaciens活菌數(shù)顯著低于其與β-環(huán)糊精、麥芽糊精、海藻糖作為復(fù)合保護(hù)劑時(shí)的活菌數(shù)。其中阿拉伯膠與海藻糖作為復(fù)合保護(hù)劑時(shí)活菌數(shù)最高,為8.1(lg(CFU/g))。第2組和第3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與第1組類似,組內(nèi)活菌數(shù)最高的保護(hù)劑分別是脫脂乳粉與海藻糖、酪蛋白酸鈉與海藻糖。可見(jiàn)加入海藻糖作為保護(hù)劑對(duì)提高固體制劑中P. membranaefaciens活菌數(shù)具有顯著作用,這可能與海藻糖能和微生物細(xì)胞膜組分形成氫鍵,取代水的位置,從而提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性有關(guān)[19]。3 組實(shí)驗(yàn)中,阿拉伯膠與海藻糖作為復(fù)合保護(hù)劑時(shí),制劑中酵母菌活菌數(shù)最高。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇阿拉伯膠和海藻糖作為復(fù)合保護(hù)劑。

圖3 保護(hù)劑種類對(duì)固體制劑中酵母活菌數(shù)的影響Fig. 3 Effect of protectants on the number of viable cells in solid preparation

2.3.2 阿拉伯膠與海藻糖質(zhì)量比對(duì)固體制劑酵母活菌數(shù)的影響

在噴霧干燥時(shí),不同保護(hù)劑的配比對(duì)微生物的抗逆性也有一定的影響[20-22],因此考察阿拉伯膠與海藻糖質(zhì)量比對(duì)固體制劑中P. membranaefaciens活菌數(shù)的影響至關(guān)重要。由圖4可知,隨著海藻糖所占比例的增加,固體制劑活菌數(shù)先升高后降低,當(dāng)阿拉伯膠與海藻糖質(zhì)量比為1∶1時(shí)活菌數(shù)最高,為8.07(lg(CFU/g))。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇阿拉伯膠與海藻糖質(zhì)量比為1∶1作為復(fù)合保護(hù)劑。

圖4 阿拉伯膠與海藻糖質(zhì)量比對(duì)固體制劑酵母活菌數(shù)的影響Fig. 4 Effect of ratio between gum Arabic and trehalose on the number of viable cells in solid preparation

2.3.3 保護(hù)劑質(zhì)量濃度對(duì)固體制劑酵母活菌數(shù)的影響

圖5 保護(hù)劑質(zhì)量濃度對(duì)固體制劑酵母活菌數(shù)的影響Fig. 5 Effect of protectant concentration on the number of viable cells in solid preparation

由圖5可知,固體制劑中P. membranaefaciens活菌數(shù)隨著保護(hù)劑質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),保護(hù)劑質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí),活菌數(shù)最高。在噴霧干燥過(guò)程中,當(dāng)保護(hù)劑質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí),對(duì)酵母菌保護(hù)作用減弱,菌體暴露在高溫下導(dǎo)致其死亡;而當(dāng)保護(hù)劑質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí),形成的顆粒直徑增加,為了達(dá)到干燥目的,則需延長(zhǎng)干燥時(shí)間,造成菌體暴露在高溫下的時(shí)間延長(zhǎng),從而導(dǎo)致固體制劑中活菌數(shù)迅速降低[23-24]。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇保護(hù)劑質(zhì)量濃度為100 g/L。

2.3.4 霧化壓強(qiáng)對(duì)固體制劑酵母活菌數(shù)的影響

圖6 霧化壓強(qiáng)對(duì)固體制劑酵母活菌數(shù)的影響Fig. 6 Effect of atomization pressure on the number of viable cells in solid preparation

如圖6所示,隨著霧化壓強(qiáng)的增大,固體制劑中P. membranaefaciens活菌數(shù)先升高后降低,當(dāng)霧化壓強(qiáng)為200 kPa時(shí),活菌數(shù)最高,為8.08(lg(CFU/g))。在噴霧干燥過(guò)程中,增大霧化壓強(qiáng)可以減小液滴大小,提高霧化效果。但霧化壓強(qiáng)過(guò)高時(shí),菌體由噴嘴噴出時(shí)受到的剪切力增大,導(dǎo)致菌體損傷甚至死亡[25-26]。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇霧化壓強(qiáng)為200 kPa。

2.3.5 進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)固體制劑酵母活菌數(shù)的影響

圖7 進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)固體制劑酵母活菌數(shù)的影響Fig. 7 Effect of inlet temperature on the number of viable cells in solid preparation

進(jìn)風(fēng)溫度是影響噴霧干燥效果的主要因素之一[27-29]。由圖7可知,隨著進(jìn)風(fēng)溫度的升高,固體制劑中P. membranaefaciens活菌數(shù)呈上升趨勢(shì),在110 ℃達(dá)到最大值,但與100 ℃無(wú)顯著性差異。繼續(xù)升高進(jìn)風(fēng)溫度至120 ℃,活菌數(shù)維持不變。在噴霧干燥過(guò)程中,隨著進(jìn)風(fēng)溫度的升高,酵母菌表面的水分蒸發(fā)加快,干燥時(shí)間縮短,單位質(zhì)量制劑中酵母活菌數(shù)增加。但是,酵母菌作為一種熱敏性微生物,雖然保護(hù)劑對(duì)菌體起到一定的保護(hù)作用,但過(guò)高的溫度也會(huì)導(dǎo)致菌體在噴霧干燥過(guò)程中大量死亡[27]。因此,當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度超過(guò)120 ℃后,制劑中活菌數(shù)迅速降低。綜合考慮溫度對(duì)酵母菌活性的影響和能耗等因素,最終選擇100 ℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)風(fēng)溫度。

2.3.6 進(jìn)料速率對(duì)固體制劑酵母活菌數(shù)的影響

圖8 進(jìn)料速率對(duì)干粉中活菌數(shù)的影響Fig. 8 Effect of feeding rate on the number of viable cells in solid preparation

如圖8所示,隨著進(jìn)料速率的提高,活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)進(jìn)料速率為15 mL/min時(shí),固體制劑中P. membranaefaciens活菌數(shù)最高,為8.35(lg(CFU/g))。進(jìn)料速率較低時(shí),單位物料承受的熱量增加,導(dǎo)致菌體因受熱過(guò)多而出現(xiàn)部分死亡,在進(jìn)料速率達(dá)到15 mL/min時(shí),進(jìn)料速率與其他影響因素的相互作用達(dá)到平衡,制劑中活菌數(shù)達(dá)到最大。隨著進(jìn)料速率的進(jìn)一步增加,單位時(shí)間內(nèi)霧化的小液滴增多,物料表面水分蒸發(fā)量減少,最終導(dǎo)致固體制劑中含水量增加,因而單位質(zhì)量固體制劑中酵母活菌數(shù)降低[18,30]。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇進(jìn)料速率為15 mL/min。

2.4 固體制劑的水分含量及保存期間酵母菌的存活率

在單因素試驗(yàn)優(yōu)化的條件下(阿拉伯膠與海藻糖質(zhì)量比1∶1、壁材質(zhì)量濃度100 g/L、霧化器壓強(qiáng)200 kPa、進(jìn)風(fēng)溫度100 ℃、進(jìn)料速率15 mL/min)進(jìn)行噴霧干燥,獲得的固體制劑活菌數(shù)為2.25×108CFU/g;水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.78%,達(dá)到GB 20287—2006《農(nóng)用微生物菌劑標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)農(nóng)用微生物菌劑水分含量的要求。從圖9可以看出,固體制劑中P. membranaefaciens存活率均隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢降低,保存90 d后,P. membranaefaciens的存活率分別為66.97%(25 ℃)和82.91%(4 ℃),表明該固體制劑于4 ℃保存效果明顯優(yōu)于25 ℃。

圖9 固體制劑在25 ℃和4 ℃保存時(shí)酵母菌的存活率Fig. 9 Survival rate of yeast in solid preparation preserved at 25 or 4 ℃

2.5 固體制劑對(duì)桃果實(shí)軟腐病的控制作用

圖10 25 ℃和4 ℃保存90 d的固體制劑的生防效果Fig. 10 Biocontrol effect of solid preparation stored at 25 or 4 ℃ for 90 days

由圖10可以看出,CK組(陰性對(duì)照)和陽(yáng)性對(duì)照組的腐爛率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。新鮮酵母、25 ℃和4 ℃保存90 d的固體制劑對(duì)桃果實(shí)軟腐病均有顯著的控制效果。4 ℃保存90 d的固體制劑的控制效果(發(fā)病率37.04%)與新鮮制備的酵母(腐爛率31.48%)雖有顯著性差異(P＜0.05),但控制效果仍然非常明顯。因此該固體制劑于4 ℃保存90 d后,仍然具有良好的防治效力,具備商業(yè)化開發(fā)和實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)篩選到1 株對(duì)桃果實(shí)采后軟腐病具有良好防治效力的拮抗酵母P. membranaefaciens。該拮抗酵母處理的桃果實(shí)貯藏72 h后,軟腐病引起的腐爛率(26.23%)顯著低于對(duì)照(95.70%),還可以顯著降低桃果實(shí)采后自然腐爛率,且對(duì)桃果實(shí)品質(zhì)無(wú)顯著不良影響。因此,該拮抗酵母應(yīng)用于桃果實(shí)采后病害的控制,可減少化學(xué)農(nóng)藥的使用,對(duì)保障食品安全和環(huán)境保護(hù)具有重要意義,具有良好的應(yīng)用前景。單因素試驗(yàn)優(yōu)化的噴霧干燥法制備該拮抗酵母固體制劑的條件為:保護(hù)劑阿拉伯膠與海藻糖的質(zhì)量比1∶1、保護(hù)劑質(zhì)量濃度100 g/L、霧化器壓強(qiáng)200 kPa、進(jìn)風(fēng)溫度100 ℃、進(jìn)料速率15 mL/min。制備的P. membranaefaciens固體制劑在25 ℃和4 ℃保藏90 d后,酵母存活率分別為66.97%和82.91%。4 ℃保存90 d的固體制劑處理的桃果實(shí)采后軟腐病發(fā)病率(37.04%)與新鮮制備的拮抗酵母處理的桃果實(shí)發(fā)病率(31.48%)雖有顯著性差異,但控制效果仍然非常明顯。該拮抗酵母噴霧干燥固體制劑制備技術(shù)的建立,可加速拮抗酵母在桃果實(shí)采后病害控制中實(shí)際應(yīng)用的進(jìn)程,促進(jìn)拮抗酵母生防制劑的產(chǎn)業(yè)化。