1 株副溶血性弧菌裂解性噬菌體VpJYP2的生物學特性及應(yīng)用

江艷華,王聯(lián)珠,李風鈴,曲 夢,郭瑩瑩,翟毓秀,姚 琳

(中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室,山東 青島 266071)

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海洋環(huán)境和海產(chǎn)品中廣泛存在的食源性致病菌,能引起人類急性腸胃炎、傷口感染和敗血癥[1]。在世界范圍內(nèi),尤其是亞洲和美國,經(jīng)常有副溶血性弧菌感染疾病爆發(fā)的報道[2]。在我國,副溶血性弧菌是每年引起食物中毒發(fā)生率最高的微生物病原[3-5]。食源性致病菌控制技術(shù)一直以來都是研究熱點,副溶血性弧菌作為海產(chǎn)品特有的食源性致病菌,其控制技術(shù)也受到廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的食源性致病菌控制技術(shù)主要基于抗菌藥物、化學保鮮劑等化學制劑,隨著社會的發(fā)展,食品的安全性以及抗菌藥物引起的耐藥性問題引發(fā)人們對化學制劑的擔憂,因此,開發(fā)安全性高、高效、低廉的生物抑菌劑具有重要意義。噬菌體是細菌的病毒,在自然界中廣泛存在,裂解性噬菌體能專一地引起宿主細胞的裂解而導(dǎo)致細菌死亡,為食源性致病菌的控制提供了一種新的手段[6]。噬菌體裂解宿主特異性強、生產(chǎn)成本低,對人和動物安全,不易產(chǎn)生耐受性,在致病菌的控制方面具有優(yōu)于化學制劑的特點[7-8]。許多食源性致病菌的噬菌體陸續(xù)被分離,并顯示出顯著的殺菌作用,其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越多[9-12]。目前,己報道的副溶血性弧菌裂解性噬菌體數(shù)量有限,為了豐富該致病菌的噬菌體庫,從中篩選具有潛在應(yīng)用價值的菌株,本實驗對從貝類樣品中分離到的1 株裂解性副溶血性弧菌噬菌體進行生物學特性分析,并探討該噬菌體對生三文魚片中副溶血性弧菌的控制作用,旨在為其進一步的應(yīng)用研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

宿主菌為副溶血性弧菌,購自美國典型微生物保藏中心,編號為ATCC17802。

噬菌體VpJYP2,由本實驗室從貝類樣品中分離得到,能裂解副溶血性弧菌ATCC17802。

1.1.2 樣品

凍生三文魚購自青島當?shù)爻?實驗前采用GB 4789.7—2013《食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》[13]方法測定樣品中副溶血性弧菌的污染情況,無副溶血性弧菌檢出即可用于實驗。將樣品解凍,在低溫條件下無菌操作將樣品切成約3 cm×5 cm的片狀(約10 g),備用。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂 北京陸橋生物技術(shù)有限公司;營養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯中添加0.75%瓊脂配制而成;弧菌顯色培養(yǎng)基 法國科瑪嘉公司;聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)8000、平衡酚 北京索萊寶科技有限公司;DNase I、RNase A、蛋白酶K、DNA分子質(zhì)量標準 寶生物工程(大連)有限公司;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、氯化銫(CsCl) 生工生物工程(上海)有限公司;SM緩沖液(每升溶液含5.8 g NaCl、2 g MgSO4·7H2O、50 mL 1 mol/L pH 7.5 Tris-HCl、5 mL 2%明膠溶液,121 ℃高壓滅菌20 min,4 ℃保存)。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌器、生化培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司;恒溫培養(yǎng)振蕩箱 上海智城分析儀器制造有限公司;生物安全柜 美國Nuaire公司;JEM-1200EX型透射電鏡 日本Jeol公司。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體的分離純化和效價測定

采用雙層平板法進行噬菌體的分離純化和效價測定[14]。將宿主菌接種于3% NaCl營養(yǎng)肉湯中活化,36 ℃培養(yǎng)至約108～109CFU/mL。將采集的貝類樣品勻漿,取10 g樣品加入90 mL 3% NaCl營養(yǎng)肉湯中,同時加入5 mL上述宿主菌懸液,36 ℃培養(yǎng)過夜,將培養(yǎng)液8 500 r/min離心10 min,收集上清液,用0.22 μm的濾膜過濾除菌,收集到的濾液即為噬菌體懸液。用SM緩沖液對噬菌體懸液進行適當稀釋,取適宜稀釋度各100 μL與200 μL培養(yǎng)過夜的宿主菌懸液混合,加入5 mL 3% NaCl營養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基(溶解后在46～50 ℃保溫),充分混勻后倒于預(yù)先制備好的3% NaCl營養(yǎng)瓊脂固體平板上,待其凝固后于36 ℃培養(yǎng)24 h,觀察平板上噬菌斑情況,挑取直徑大、生長均勻的單斑于SM緩沖液中,適當稀釋后按以上分離操作進行純化,重復(fù)3～4 次后即得到純化的噬菌體,命名為VpJYP2。采用相同的操作,對適宜稀釋度的噬菌斑進行計數(shù),經(jīng)計算后獲得噬菌體效價。

1.3.2 噬菌體顆粒的濃縮和純化

參考文獻[15]方法。將宿主菌培養(yǎng)至濃度約109CFU/mL,以最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)加入噬菌體懸液,培養(yǎng)至細菌完全裂解。在裂解液中加入DNase I和RNase A至終質(zhì)量濃度為l mg/L,室溫放置30 min。加入NaCl至終濃度為1 mol/L,攪拌使其溶解,冰浴1 h。4 ℃、8 500 r/min離心15 min去除其中的細菌碎片,收集上清液,加入終質(zhì)量濃度為10 g/100 mL的PEG 8000,緩慢攪拌溶解,冰浴1 h以上,使噬菌體顆粒沉淀。4 ℃、8 500 r/min離心30 min,棄盡上清液,將沉淀懸于適量SM溶液中。加入等體積的氯仿抽提,溫和振蕩30 s,4 ℃、5 000 r/min離心15 min,回收含噬菌體顆粒的水相。采用CsCl平衡梯度等密度離心,收集純化的噬菌體顆粒,透析,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 噬菌體的生物學特性分析

1.3.3.1 噬菌體的形態(tài)學鑒定

取銅網(wǎng)浸入純化的噬菌體懸液中,待其作用5 min,用濾紙吸去多余的液體,用2%的磷鎢酸染色5 min,自然干燥后采用透射電鏡進行觀察。

1.3.3.2 噬菌體核酸的提取和全基因組測序

參考文獻[15]方法。在純化的噬菌體懸液中加入DNase I至終質(zhì)量濃度為10 μg/mL、RNase A至終質(zhì)量濃度為5 μg/mL,37 ℃溫育1 h。加入pH 8.0 EDTA至終濃度為20 mmol/mL,滅活DNase I。加蛋白酶K至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL、SDS至終質(zhì)量分數(shù)為0.5%,混勻,56 ℃溫育1 h,然后冷卻至室溫。用等量平衡酚抽提,12 000 r/min離心5 min,收集水相,用等量平衡酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1,V/V)抽提,12 000 r/min離心5 min,收集水相,再用氯仿-異戊醇(24∶1,V/V)抽提,12 000 r/min離心5 min,取上層水相2 倍體積的無水乙醇沉淀噬菌體核酸,12 000 r/min離心5 min,再用70%乙醇溶液洗滌沉淀2 次,用TE緩沖液溶解沉淀核酸。依托生工生物工程(上海)股份有限公司的MiSeq測序平臺進行全基因組測序,采用SPAdes軟件(http://cab.spbu.ru/software/spades)對序列進行拼接,全基因組使用RAST(http://rast.nmpdr.org)進行在線注釋,使用在線BLASTp工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)對注釋蛋白進行功能預(yù)測。

1.3.3.3 熱穩(wěn)定性實驗

按文獻[16]的方法,取效價約108PFU/mL的噬菌體懸液1.0 mL于無菌EP管中,分別于40、50、60、70 ℃的水浴中作用10、20、30、40、50、60 min,待作用時間結(jié)束后取出并立即置于冰浴中冷卻,測定噬菌體效價。

1.3.3.4 pH值穩(wěn)定性實驗

按文獻[16]的方法,取效價約109PFU/mL的噬菌體懸液0.1 mL于無菌EP管中,分別加入0.9 mL pH值不同的3% NaCl營養(yǎng)肉湯,36 ℃水浴作用1 h,取出后測定噬菌體效價。

1.3.3.5 最佳MOI的測定

按文獻[16]的方法,將宿主菌培養(yǎng)至對數(shù)生長早期,調(diào)麥氏濃度為0.5,即相當于約1×108CFU/mL。按照MOI分別為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1的比例加入噬菌體和宿主菌,36 ℃、150 r/min培養(yǎng)3.5 h后,12 000 r/min離心10 min,收集上清液測定噬菌體效價。以產(chǎn)生最高噬菌體效價的MOI為最佳MOI。

1.3.3.6 一步生長曲線的測定

按文獻[16]的方法稍作改動,將宿主菌培養(yǎng)至對數(shù)生長早期,調(diào)菌液麥氏濃度為0.5,然后以最佳MOI的比例加入噬菌體液,與宿主菌液混合后36 ℃孵育15 min,然后12 000 r/min離心30 s,棄上清液,用3% NaCl營養(yǎng)肉湯洗滌菌體沉淀2 次。加入5 mL 36 ℃預(yù)熱的3% NaCl營養(yǎng)肉湯懸浮沉淀并充分混勻,迅速置于36 ℃振蕩培養(yǎng),同時開始計時,在0、5 min和之后每隔10 min取樣一次,12 000 r/min離心30 s,取上清液測定噬菌體在每一時間段的效價。以感染時間為橫坐標、噬菌體效價為縱坐標,繪制一步生長曲線。

1.3.4 噬菌體對生三文魚片中副溶血性弧菌的減菌作用

1.3.4.1 樣品處理

按1.3.2節(jié)方法獲得高濃度噬菌體懸液(約1011PFU/mL),然后稀釋成適宜的使用濃度。每片生三文魚表面接種100 μL 1×106CFU/mL的副溶血性弧菌懸液(終濃度為104CFU/g),低溫放置2 h讓其充分吸附到樣品上。取200 μL不同濃度噬菌體懸液(MOI分別為0、1、10、100、1 000、10 000)添加至人工污染了副溶血性弧菌的三文魚片表面。將處理好樣品置于無菌封口袋中,于4、15 ℃和25 ℃貯藏2 h,測定副溶血性弧菌數(shù),確定噬菌體最佳添加量。另取樣品,按以上方法人工污染副溶血性弧菌,然后添加最佳濃度的噬菌體,將處理好樣品置于無菌封口袋中,分別在4、15 ℃和25 ℃貯藏一定時間,測定副溶血性弧菌數(shù)。

1.3.4.2 副溶血性弧菌的計數(shù)

將10 g樣品加入90 mL磷酸鹽緩沖液中,均質(zhì),制成1∶10樣品勻液。為避免噬菌體對副溶血性弧菌的干擾,取10 mL樣品勻液,8 000 r/min離心10 min,沉淀重懸于10 mL磷酸鹽緩沖液中,取100 μL涂布弧菌顯色培養(yǎng)基平板;對于菌濃度極低樣品,將10 mL勻液沉淀重懸于1 mL磷酸鹽緩沖液中,涂布3 塊平板(檢出限為1 CFU/g)。在36 ℃培養(yǎng)18～24 h,計數(shù)平板上典型副溶血性弧菌菌落數(shù),從而計算樣品中副溶血性弧菌含量[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的生物學特性

2.1.1 噬菌體的形態(tài)鑒定

噬菌體VpJYP2在雙層平板上形成圓形、透明、邊緣整齊的噬菌斑,直徑約為1～2 mm,周圍有暈圈,呈現(xiàn)出裂解性噬菌體的噬菌斑特征(圖1)。純化的噬菌體VpJYP2經(jīng)透射電鏡觀察,頭部呈二十面體立體結(jié)構(gòu),直徑約64 nm,噬菌體的尾部長約70 nm,帶收縮性尾鞘,寬約20 nm(圖2)。根據(jù)《國際病毒分類委員會第9次報告》提出的噬菌體分類與命名標準,噬菌體VpJYP2屬于有尾噬菌體目(Caudovirales)肌尾病毒科(Myoviridae)[18]。

圖1 噬菌體VpJYP2的噬菌斑Fig. 1 Plaques of phage VpJYP2

圖2 噬菌體VpJYP2的透射電鏡圖Fig. 2 Transmittance electron micrograph of phage VpJYP2

2.1.2 噬菌體的基因組特性

表1 噬菌體VpJYP2部分ORF功能預(yù)測Table 1 Functional prediction of some ORF of phage VpJYP2

噬菌體VpJYP2的核酸為雙鏈DNA,基因組全長為25 363 bp,G+C含量為39.56%。通過全基因組RAST在線注釋和BLASTp分析,預(yù)測到該基因組含有45 個開放閱讀框(open reading frames,ORF),核酸序列長度在114～1 134 bp之間,對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列在37～377 aa之間。其中推定為己知功能的僅有13 個序列,其余為未知功能的假定蛋白序列,其中16 個序列未找到具有同源性的序列。表1列出了13 個預(yù)測的功能蛋白序列,主要包含DNA復(fù)制和調(diào)控相關(guān)蛋白、噬菌體包裝蛋白、噬菌體頭部和頸部相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白等。ORF1編碼噬菌體核酸外切酶,ORF2編碼噬菌體必需重組功能蛋白,ORF4編碼單鏈DNA結(jié)合蛋白,ORF43編碼ATP結(jié)合蛋白,為DNA復(fù)制和調(diào)控的相關(guān)基因。ORF23和ORF29編碼噬菌體末端酶,在噬菌體包裝時起重要作用。ORF17～20編碼噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白,其中ORF17、ORF19和ORF20編碼噬菌體頭部蛋白,ORF18編碼噬菌體頸部蛋白。ORF33和ORF41編碼卷曲螺旋蛋白,通常為結(jié)構(gòu)蛋白或轉(zhuǎn)錄因子的低聚結(jié)構(gòu)域。未預(yù)測到與己知序列同源的裂解酶和穿孔蛋白基因。

2.1.3 噬菌體的熱穩(wěn)定性

圖3 噬菌體VpJYP2的熱穩(wěn)定性Fig. 3 Thermal stability of phage VpJYP2

如圖3所示,噬菌體VpJYP2在40 ℃和50 ℃作用1 h后,效價基本不變,表明其活性不受溫度影響;當溫度為60 ℃時,VpJYP2效價下降緩慢,60 min后降低了1.5(lg(PFU/mL)),VpJYP2保持了較高的活性;當溫度高于70 ℃,VpJYP2效價迅速下降,作用10 min效價下降了4.5(lg(PFU/mL)),作用20 min后下降了5.6(lg(PFU/mL)),作用30 min后降至檢測水平以下。結(jié)果表明,高溫會破壞噬菌體VpJYP2的活性。

2.1.4 噬菌體的pH值穩(wěn)定性

圖4 噬菌體VpJYP2的最適pH值Fig. 4 pH stability of phage VpJYP2

如圖4所示,噬菌體VpJYP2在pH 4～11時,效價與初始效價無顯著性差異,維持良好的裂解活性,說明該噬菌體對pH值的適應(yīng)范圍較廣;當pH值為3時,效價降低4.2(lg(PFU/mL));當pH≤2和pH≥12時,噬菌體基本喪失活性。

2.1.5 噬菌體的最佳MOI

如表2所示,當MOI為0.01時,噬菌體VpJYP2感染宿主產(chǎn)生子代噬菌體效價為3.9×109PFU/mL,在6 個MOI中最高。因此,該噬菌體的最佳MOI為0.01。

表2 噬菌體VpJYP2的最佳MOITable 2 Optimal multiplicity of infection of phage VpJYP2

2.1.6 噬菌體的一步生長曲線

圖5 噬菌體VpJYP2的一步生長曲線Fig. 5 One-step growth curve of VpJYP2

如圖5所示,噬菌體VpJYP2感染宿主菌后的5 min內(nèi)效價沒有明顯變化,表明其潛伏期約為5 min,從5 min后效價開始上升,一直持續(xù)到60 min,之后效價趨于穩(wěn)定,說明噬菌體裂解期約為55 min。根據(jù)裂解量=裂解末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度計算得到,噬菌體VpJYP2裂解量=4.5×109/1.0×108=45。

2.2 噬菌體對生三文魚片中副溶血性弧菌的減菌作用

2.2.1 噬菌體的最佳添加量

圖6 不同濃度噬菌體VpJYP2對生三文魚片中副溶血性弧菌的減菌作用Fig. 6 Effect of different concentrations of phage VpJYP2 on reduction of V. parahaemolyticus counts on raw salmon fillets

由圖6可以看出,在4、15 ℃和25 ℃條件下,隨著MOI的增加,樣品中副溶血性弧菌數(shù)逐漸降低。當MOI為10 000,即噬菌體添加量為108PFU/g時,在4、15 ℃和25 ℃貯藏2 h后副溶血性弧菌數(shù)降低最多,分別降低了1.4、2.2(lg(CFU/g))和3.4(lg(CFU/g))。表明噬菌體添加量越高,減菌效果越好。考慮到制備更高濃度的噬菌體會增加實驗操作的難度和成本,選擇噬菌體的最佳添加量為108PFU/g。

2.2.2 不同貯藏溫度下噬菌體的減菌作用

在生三文魚樣品中添加108PFU/g的噬菌體,在不同溫度下貯藏時,副溶血性弧菌的變化結(jié)果如圖7所示。在4 ℃條件下,未添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌數(shù)隨著時間的延長逐漸降低,到7 d降至約1.2(lg(CFU/g));而添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌在8 h即可降至檢測限以下,此后一直未檢出。在15 ℃條件下,未添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌數(shù)隨著時間的延長緩慢增加,添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌數(shù)先降低后增加,在8 h時降至最低,與初始菌數(shù)相比降低了3.4(lg(CFU/g))。在25 ℃條件下,未添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌數(shù)隨著時間的延長迅速增加,添加噬菌體樣品中副溶血性弧菌數(shù)迅速降低,在4 h降至檢測限以下,而后逐漸升高。3 個溫度下,所有添加噬菌體的實驗組副溶血性弧菌數(shù)均顯著低于未添加噬菌體的對照組(P＜0.05)。

圖7 不同溫度貯藏條件下噬菌體VpJYP2對生三文魚片中副溶血性弧菌的減菌作用Fig. 7 Effect of phage VpJYP2 on reduction of V. parahaemolyticus counts on raw salmon fillets during storage at different temperatures

3 討 論

噬菌體在環(huán)境中分布極廣,凡是有細菌的場所,就可能有相應(yīng)噬菌體的存在。據(jù)估計,噬菌體豐度是原核生物的5～10 倍左右,是自然界最豐富的生物體[19],因此,自然界提供了豐富的噬菌體庫。然而,現(xiàn)階段分離到的噬菌體還較少,對噬菌體的基因信息和應(yīng)用的挖掘也極其有限。副溶血性弧菌作為一種重要的食源性致病菌,對其噬菌體的研究和該病原菌的重要性很不匹配。

目前分離的副溶血性弧菌噬菌體主要分屬于長尾病毒科(Siphoviridae)[20-22]、短尾病毒科(Podoviridae)[16,23-25]、肌尾病毒科[21,26-28]和蓋病毒科(Tectiviridae)[22,29],均為二十面體結(jié)構(gòu),但大小不同,生物學特性、基因組大小也不同。其中以副溶血性弧菌ATCC17802為宿主菌的噬菌體有qdvp001、VPMS1、VPp1、VPp2和VPp3。噬菌體VPMS1屬于短尾病毒科,頭部直徑60 nm,尾部長10 nm,基因組大小為42.3 kb[23];噬菌體qdvp001屬于肌尾病毒科,頭部直徑79 nm,尾長118 nm,基因組大小為35 kb,耐受溫度40～60 ℃,最適pH值為4～10,最佳MOI為0.001[26];VPp2屬于肌尾病毒科,頭部直徑64 nm,尾部長114 nm,基因組大小為2 kb,最佳MOI為0.000 01,潛伏期為5 min,裂解量為11.1[28];VPp3屬于肌尾病毒科,頭部直徑89 nm,尾部長106 nm,基因組大小為2 kb,最佳MOI為0.001,潛伏期為25 min,裂解量為45.3[28];VPp1屬于蓋噬菌體科,頭部直徑為44 nm,無尾,基因組大小為15 kb,最佳MOI為0.000 1,潛伏期為10 min,裂解量為90.3[29]?？梢钥闯?本實驗分離到的噬菌體VpJYP2和這幾株菌在形態(tài)、基因組大小和生物學特性方面均不同。從VpJYP2的生物學特性看,該菌株耐受60 ℃以下的溫度,最適pH值范圍較寬,在pH 4～11都能保持很高的活性,最佳MOI低,潛伏期短,裂解量較高,這些特性都賦予該菌株較高的裂解效率和應(yīng)用潛力。本實驗利用高通量測序儀對噬菌體VpJYP2進行了全基因組測序,利用BLASTp進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該噬菌體有16 個ORF未找到相似序列,而其他ORF與相似序列的同源性也很低。在ORF分析中,未找到裂解酶基因序列和穿孔蛋白基因序列,這增加了挖掘該噬菌體功能基因的難度。后期希望通過其他方式找到相關(guān)裂解基因,挖掘基因的功能與應(yīng)用。

利用噬菌體控制副溶血性弧菌有少量報道,這些研究顯示噬菌體可降低海產(chǎn)食品或養(yǎng)殖海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的含量。噬菌體SHOU24在常溫條件下對即食對蝦中副溶血性弧菌的生長具有良好抑制作用,能使副溶血性弧菌數(shù)下降1(lg(CFU/g))[21];此外,采用不同劑量的混合噬菌體VppMIX處理污染的黃魚片,在25 ℃保藏12 h后,能使樣品中副溶血性弧菌數(shù)比對照組低1.41～4.98(lg(CFU/g))[22]。噬菌體qdvp001能使養(yǎng)殖牡蠣體內(nèi)副溶血性弧菌數(shù)下降3 個數(shù)量級[26];噬菌體VPp1能使實驗室養(yǎng)殖規(guī)模下的牡蠣體內(nèi)副溶血性弧菌數(shù)降低2.35～2.76(lg(CFU/g)),能使工廠化養(yǎng)殖規(guī)模下的牡蠣體內(nèi)副溶血性弧菌降低1.11(lg(CFU/g))[30-31];噬菌體pVp-1采用浸浴的方式作用72 h后能使牡蠣食品中副溶血性弧菌由8.9×106CFU/g降低至14 CFU/g,采用噴淋的方式處理12 h后能使副溶血性弧菌由1.44×106CFU/g降低至1.94 CFU/g[32]。這些報道表明,噬菌體在副溶血性弧菌的控制方面效果顯著。本實驗探討了噬菌體VpJYP2對生三文魚片中副溶血性弧菌的減菌作用,結(jié)果顯示,該噬菌體能顯著殺滅生三文魚片中的副溶血性弧菌,溫度越低,對樣品中副溶血性弧菌的控制效果越明顯。推測可能是低溫抑制副溶血性弧菌的生長,并使菌量逐漸減少,噬菌體作用于副溶血性弧菌表面的相對數(shù)量則會增加,從而裂解效率升高,導(dǎo)致樣品中殘留的菌數(shù)降低;當溫度較高時,副溶血性弧菌生長速度較快,如果噬菌體作用不到樣品中的副溶血性弧菌,殘余菌會快速增殖,在樣品中含量升高,同時噬菌體作用于副溶血性弧菌表面的相對數(shù)量則會減少,從而導(dǎo)致裂解效率降低。然而,使用噬菌體處理樣品后,在所有測試時間點副溶血性弧菌的含量都顯著低于未用噬菌體處理的對照組,因此,噬菌體VpJYP2具有一定的應(yīng)用潛力。

4 結(jié) 論

本研究對1 株副溶血性弧菌裂解性噬菌體VpJYP2進行生物學特性分析和在水產(chǎn)品中應(yīng)用。結(jié)果表明:1)噬菌體VpJYP2的噬菌斑清晰,為裂解性噬菌體,其頭部呈二十面體立體結(jié)構(gòu),直徑約64 nm,尾部長約70 nm,尾鞘帶寬約20 nm,屬于肌尾病毒科(Myoviridae);2)VpJYP2基因組全長25 363 bp,含有45 個ORF,推定為己知功能的有13 個,未找到相似序列的有16 個,未發(fā)現(xiàn)裂解酶基因和穿孔蛋白基因序列;3)VpJYP2在40～50 ℃穩(wěn)定,在pH 4～11穩(wěn)定,最佳MOI為0.01,感染宿主菌的潛伏期約為5 min,裂解期約為55 min,裂解量約為45;4)VpJYP2能顯著降低生三文魚片中副溶血性弧菌的含量,噬菌體濃度越高,殺菌效果越明顯,結(jié)合低溫處理,VpJYP2對樣品中副溶血性弧菌的控制效果更好。結(jié)果表明,VpJYP2具有作為副溶血性弧菌生物殺菌劑的應(yīng)用潛力。