煙曲霉單寧酶Kex2位點突變及酶學特性表征

盧海強,陳 偉,黃 蕾,谷新晰,田洪濤

(河北農業(yè)大學食品科技學院,河北 保定 071000)

單寧酶(EC 3.1.1.20)是可將單寧中的酯鍵與縮酚羧鍵斷裂,生成葡萄糖和沒食子酸等物質一類酶的總稱,在速溶茶、葡萄酒和啤酒等食品加工領域具有巨大的應用潛力[1-2]。雖然對單寧酶的研究廣泛且具有較長歷史,但是到目前為止,主要集中在產酶微生物的篩選及產酶特性分析方面[3-5]。單寧酶蛋白往往需要形成二硫鍵、氨基酸的糖基化及蛋白的正確折疊等表達后加工,才能夠成為具有活性的酶蛋白分子[6-7],這使得僅有數個單寧酶基因被克隆并表達,涉及的微生物有米曲霉、黑曲霉、植物乳桿菌等[8-11]。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)作為優(yōu)良的表達宿主,己經實現了上百種酶基因的高效表達[12],探究影響單寧酶在巴斯德畢赤酵母正確表達因素的意義重大。

本課題組前期從濃香大曲中篩選獲得產單寧酶嗜熱真菌煙曲霉(Aspergillus fumigatus)HBHF5,該菌屬條件致病菌,具有一定潛在的安全風險。巴斯德畢赤酵母GS115菌株為畢赤酵母表達系統(tǒng)常用菌株,其生理學背景清楚,屬于安全菌株。為此,將煙曲霉菌株中的單寧酶afTanA基因在巴斯德畢赤酵母GS115中進行表達。研究發(fā)現畢赤酵母表達的重組單寧酶(AfTanA)由2 個30 kDa左右大小亞基組成,且酶的穩(wěn)定性降低,推測這些性質的改變與Kex2蛋白酶作用相關[13-14]。單寧酶中普遍含有1～2 個Kex2位點,到目前為止,只有Koseki等[15]對米曲霉來源的單寧酶中Kex2位點進行了研究,而單寧酶AfTanA中Kex2位點對酶學特性影響還不清楚。因此,亟待深入開展Kex2位點對單寧酶AfTanA性質影響的研究工作。

本研究以前期獲得的重組單寧酶AfTanA為材料,構建AfTanA蛋白質三維結構模型,分析Kex2位點在單寧酶蛋白結構中的位置及其作用;對比單點突變體(R316A)和雙點缺失突變體(ΔRK:Lys315-Arg316)酶學性質及應用效果的差異,探討Kex2蛋白酶酶切位點對該酶酶學性質及在柿子汁應用效果的影響,以期為單寧酶的生產及性能改造提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pMDTM19T-afTanA質粒由本課題組構建并提供;巴斯德畢赤酵母GS115菌株、pPIC9k質粒 美國Invitrogen公司;FastPfuDNA聚合酶 北京全式金生物技術有限公司;T4 DNA連接酶、限制性內切酶SpeI、NotI和SalI大連寶生物有限公司;沒食子酸丙酯 浙江匝?；ぴ噭S;羅丹寧 生工生物工程(上海)股份有限公司;單寧酸 上海化學試劑公司;其他試劑均為分析純。

營養(yǎng)肉湯(Luria Broth,LB)培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基、最少葡萄糖(minimal dextrase,MD)瓊脂培養(yǎng)基、甘油(buffered glycerol,BMGY)培養(yǎng)基和甲醇誘導(buffered methanol,BMMY)培養(yǎng)基參照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊配制。

1.2 儀器與設備

立式高速低溫離心機 中國湘儀離心機公司;Tprofessional聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀 德國Biometra公司;TU-1810紫外分光光度計北京普析通用儀器有限公司;細胞電穿孔儀 美國伯樂公司;JY04S-3E型凝膠成像系統(tǒng) 北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AfTanA中Kex2酶切位點及其作用分析

使用蛋白質在線建模軟件I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)構建AfTanA突變體的三維結構模型,通過PyMOL軟件進行蛋白結構分析。使用BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行Kex2位點氨基酸序列比對分析。使用NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)軟件預測N-糖基化位點。

1.3.2 引物的設計與合成

參照前期獲得的單寧酶afTanA基因序列信息(XP_746534.1),依據Fast MultiSite Mutagenesis System要求設計單寧酶afTanA中Kex2位點突變引物,如表1所示,突變引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3.3 Kex2突變基因的構建

以pMDTM19T-afTanA質粒為模板,PCR參數:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸4 min,25 個循環(huán);72 ℃保溫10 min。參照Fast MultiSite Mutagenesis System說明書進行單寧酶afTanA基因Kex2位點的定點突變,分別構建pMDTM19T-afTanR316A和pMDTM19T-afTanΔKR突變質粒,將陽性克隆子送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

1.3.4 單寧酶突變體的構建

分別將pMDTM19T-afTanR316A、pMDTM19T-afTanΔKR和pPIC-9k質粒進行雙酶切,利用膠回收試劑盒對目的酶切產物進行回收,進行afTanA和pPIC-9k的連接反應,分別構建表達質粒pPIC9k-afTanR316A和pPIC9kafTanΔKR。采用5’AOX和3’AOX通用引物對轉化子進行驗證,將篩選重組表達質粒陽性轉化子進行測序鑒定。

測序正確的pPIC9k-afTanR316A和pPIC9k-afTanΔKR質粒經Sal I將表達質粒進行線性化處理后,電轉化至巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中,利用酶活力篩選方法對轉化子進行篩選,獲得陽性轉化子。

1.3.5 誘導表達及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

挑取單陽性轉化子至50 mL YPD培養(yǎng)基中,30 ℃、250 r/min培養(yǎng)12 h。以1%的接種量接種于200 mL BMGY中,在搖床中30 ℃、250～300 r/min生長至OD600nm為2～6(約16～18 h),室溫、8 000×g離心5 min收集細胞,去除上清液,100 mL BMMY重懸細胞,放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,維持甲醇終體積分數為0.5%,離心收集發(fā)酵液,即為粗酶液,進行酶活力測定及SDS-PAGE分析。

1.3.6 單寧酶酶學性質分析

酶活力測定參考Sharma等[16]的方法。取100 μL適當稀釋酶液與400 μL沒食子酸丙酯溶液(1.25 mmol/L,pH 5.0)混勻,于25 ℃條件反應,10 min后加入300 μL羅丹寧終止反應,加入200 μL的KOH(0.5 mol/L)溶液顯色,穩(wěn)定5 min后在520 nm波長處測定吸光度。以每分鐘生成1 μmol沒食子酸所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

1.3.6.1 pH值對突變體酶活力的影響

分別測定突變體AfTanR316A和AfTanΔKR酶液樣品在不同pH值緩沖液體系(pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、1.0)中的酶活力,確定其最適反應pH值。將突變體AfTanR316A和AfTanΔKR在pH 2.0～12.0的條件下,37 ℃處理1 h,對照為未進行處理的酶,按照標準酶活力測定方法測定酶活力,以未加金屬離子和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的酶活力計為100%,分析其pH值耐受性。

1.3.6.2 溫度對突變體酶活力的影響

將突變體AfTanR316A和AfTanΔKR在最適pH值下,分別測定0、10、20、30、40、50、60、70 ℃和80 ℃反應溫度下的酶活力,確定其最適溫度。將重組酶在40 ℃和50 ℃條件下,孵育0、5、10、20、30 min和60 min后,測定酶活力,分析其熱穩(wěn)定性。

1.3.6.3 金屬離子和化學試劑對酶活力的影響

在標準反應條件下,分別測定終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L的金屬離子(Fe3+、Cu2+、K+、Zn2+、Na+、Mg2+、Ca2+、Li+和Mn2+)、EDTA和SDS下的單寧酶活力。

1.3.7 動力學參數Km和Vmax分析

分別配制底物濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的沒食子酸丙酯溶液,在最適條件下反應5 min,測定520 nm波長處的吸光度,計算酶活力和反應速率,利用米氏方程雙倒數法求得Km及Vmax值。

1.4 數據分析及處理

每次實驗重復測定3 次,利用GraphPad Prism 5.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析,數據結果采用平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 單寧酶afTanA基因Kex2位點分析

2013年,第一個植物乳桿菌來源的單寧酶晶體結構才被解析(PDB:4JUI)[17]。單寧酶家族的AoFaeB晶體結構(PDB:3WMT)[18]由一個具有典型的a/β絲氨酸水解酶結構區(qū)域和蓋子結構域所組成,雖然該酶屬于單寧酶家族中的阿魏酸脂酶,這使得該晶體結構還無法完全提供充足真菌來源單寧酶的結構信息,但是對真菌單寧酶的分子機制提供了一定的借鑒。經對多個單寧酶序列比對分析發(fā)現,位于蓋子結構區(qū)域中的LoopFK中的K315-R316位點氨基酸普遍存在單寧酶中(圖1)。不同來源的單寧酶在該區(qū)域中表現出較強的趨異進化,其中米曲霉單寧酶(ABJ51876.1)差異最大,除在該區(qū)域有2 個連續(xù)的Kex2酶切位點外,同時還有較長的Loop結構,這表明AfTan中的Kex2位點對酶的影響很可能與之有明顯差異。

圖1 使用I-TASSER構建的AfTanA分子模型（a）及Kex2位點（b）分析Fig. 1 Molecular model of AfTanA constructed using the I-TASSER server (a) and analysis of Kex2 sites (b)

2.2 Kex2位點突變體的構建

采用一步式定點突變對afTan基因進行突變,對測序結果分析,分別成功構建突變pMDTM19T-afTanR316A、pMDTM19T-afTanΔKR克隆載體。隨后,將突變基因分別連接至pPIC9K質粒中,并成功轉入GS11中,經過對陽性克隆子誘導表達,各篩選出1 株高產菌株。

2.3 突變體的誘導表達及SDS-PAGE分析

圖2 野生型AfTanA及其突變體的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of wild-type AfTanA and mutants

將重組菌株按1.3.5節(jié)方法進行培養(yǎng)和誘導表達之后,對AfTanR316A和AfTanΔKR發(fā)酵液進行酶活力測定,25 ℃培養(yǎng)2 d發(fā)酵液中單寧酶活力分別為793 U/mL和830 U/mL。

通過對比野生型AfTanA、突變體AfTanR316A和AfTanΔKR發(fā)酵液SDS-PAGE結果(圖2),發(fā)現野生型發(fā)酵產物在約45～60 kDa區(qū)域內處出現蛋白條帶,明顯低于理論分子質量(61.9 kDa);而突變體AfTanR316A和AfTanΔKR樣品全部在100 kDa出現目標蛋白條帶,分子質量明顯偏大,這與野生型結果差異明顯。分別對上述3 種酶經去糖基化酶Endo H處理,分子質量均不同程度變小,并且從結果中能明顯發(fā)現野生型單寧酶是由2 個亞基組成(其分子質量分別為31.7 kDa和30.4 kDa),而2 個突變體均未出現類似的現象,表明Kex2位點突變體對Kex2蛋白酶的抗性明顯增強。經去糖基化處理后,兩突變體的分子質量均為70 kDa左右,較理論值大10kDa左右。經NetNGlyc 1.0分析,單寧酶AfTanA中具有8 個潛在的N-糖基化位點,經NetOGlyc 4.0分析AfTanA中含有14 處O-糖基化位點,表明單寧酶AfTanA的糖基化修飾使其分子質量明顯增大。

2.4 突變體AfTanR316A和AfTanΔKR酶學特性分析

為探究Kex2酶切位點(K315-R316)對突變體酶學特性的影響,對2 個突變體的酶學特性進行測定,結果如圖3所示。

圖3 單寧酶突變體的酶學性質比較分析Fig. 3 Characterization of AfTanR316A and AfTanΔKR

由圖3A可知,突變體在0～70 ℃范圍內均有活性,最適反應溫度均為20 ℃,屬于低溫酶。在反應溫度為0 ℃時,突變體AfTanR316A和AfTanΔKR的酶活力分別維持68%和63%以上,在60 ℃條件下,突變體AfTanR316A能夠維持10%左右酶活力,而突變體AfTanΔKR則表現出40%左右的酶活力。由圖3B可知,突變體AfTanR316A和AfTanΔKR的pH值反應范圍分別為2.0～8.0和2.0～9.0,最適反應pH值均為5.0左右。整體而言,在pH 2.0～5.0區(qū)間內,突變體AfTanR316A較AfTanΔKR活性高,而在pH 5.0～9.0區(qū)間內時,突變體AfTanΔKR較AfTanR316A活性高。由圖3C可知,2 個突變體在pH值穩(wěn)定性方面存在差異。在pH 2.0～12.0分別處理1 h后,突變體AfTanR316A和AfTanΔKR分別能夠維持60%和85%以上酶活力。突變體AfTanR316A在pH 4～8區(qū)間內相對穩(wěn)定,能夠達到85%以上酶活力,而在堿性范圍內,酶活力大幅度降低,在pH值12.0處理1 h后,AfTanR316A酶活力損失40%;由圖3D可知,2 個突變體在40 ℃處理時,酶相對穩(wěn)定,基本沒有活性的損失。50 ℃處理條件,2 個突變體的熱穩(wěn)定性能差異明顯,尤其當處理10 min以內時,AfTanΔKR能夠維持90%以上活性,而AfTanR316A則維持70%左右活性,突變體AfTanΔKR表現出相對較高的穩(wěn)定性,這表明“KR”位點不僅可以影響AfTan對Kex2酶的敏感性,同樣對酶蛋白的熱穩(wěn)定性造成了影響,這很可能是“KR”所處的Loop結構的改變所造成的。Loop結構具有較強的柔性,繼而會增加蛋白空間結構的搖擺性,而Loop結構中氨基酸的缺失,會使得Loop結構的剛性增強,繼而提高酶的熱穩(wěn)定性。

2.5 金屬離子和化學試劑對酶活力的影響及動力學參數

如表2所示,離子濃度對酶活力影響存在差異,且不同離子種類也存在較大差異?？傮w而言,兩種突變體普遍被金屬離子和化學試劑抑制,且高濃度條件(5 mmol/L)下抑制更加明顯,而突變體AfTanΔKR較AfTanR316A受金屬離子和化學試劑影響大。Fe3+對2 個突變體酶活力的抑制效應最顯著,在高濃度下,對突變體AfTanR316A和AfTanΔKR能夠抑制76%和97%酶活力。在低濃度(1 mmol/L)的條件下,除Fe3+外,其他金屬離子和化學試劑均未對突變體AfTanR316A酶活力造成影響,而突變體AfTanΔKR均不同程度受到15%～80%抑制,Mg2+對酶活力影響最低。在高濃度(5 mmol/L)條件下,除Li+外,其他金屬離子和化學試劑均對兩突變體酶活力造成顯著影響。除Fe3+離子外,Mn2+和Zn2+對酶活力均能抑制50%左右。

表2 金屬離子和化學試劑對突變體相對酶活力的影響Table 2 Effects of metal ions and chemical reagents on the activities of mutants%

以沒食子酸甲酯為底物,經動力學曲線回歸方程計算,AfTanR316AKm為1.149 mmol/L,Vmax為10.427 mmol/(L·min);AfTanΔKRKm為1.46 mmol/L,Vmax為35.84 mmol/(L·min)。兩者的Km差異不明顯,但是Vmax改變較大,AfTanΔKR的催化提高了2 倍左右。結果表明,K315-R316位點不僅可以對酶的穩(wěn)定性有影響,對于酶的催化效率影響也較為顯著。

2.6 突變單寧酶在柿子汁中的應用

柿子中富含單寧物質,經水解可生成兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素和沒食子兒茶素沒食子酸酯等小分子的酚類化合物[19],這些物質具有較強的生物活性。本研究通過測定野生型單寧酶AfTanA和2 個突變體AfTanR316A和AfTanΔKR處理柿子后的多酚類物質變化,探討在柿子汁加工中的應用潛力,結果如圖4所示。

柿子汁中多酚經單寧酶處理后差異變化較明顯,2 種突變體表現出與野生型單寧酶相似的催化效果。多酚含量平均提高約50%(約43 mg/L),這是由于大分子多酚物質(單寧)降解為小分子的酚類化合物所致,從而顯著增強柿子汁多酚含量,突變體酶同野生單寧酶一樣可應用在柿子果汁的加工中。

圖4 柿子汁水解前后多酚類物質含量分析Fig. 4 Total phenolic concentration of persimmon juice before and after hydrolysis with wild-type AfTanA and mutants, separately

3 討 論

目前,巴斯德畢赤酵母GS115表達系統(tǒng)能夠使外源蛋白被正確修飾,己成功對上百種外源基因進行了表達,是最成熟的真核表達系統(tǒng)之一。隨著研究不斷深入發(fā)現,單寧酶是由2 個或2 個以上亞基單位(30 kDa和34 kDa)連接組成一個蛋白分子質量范圍為50～320 kDa的多聚體。其中,造成這2 個亞單位產生的原因是由于Kex2蛋白酶的切割[20]。Kex2蛋白酶是畢赤酵母內源性蛋白酶,主要在蛋白合成加工過程中發(fā)揮作用[21],而該酶對外源蛋白的過度切割,必然會影響到蛋白的穩(wěn)定性和活性,因此探索單寧酶中的Kex2位點對酶學特性的影響意義重大。

經分析,兩種突變體AfTanR316A和AfTanΔKR的電泳條帶都顯現為單一的電泳條帶,表明AfTanA中Kex2位點(K315-R316)的替換和缺失都使得酶對Kex2蛋白酶抗性明顯增強,而這與Koseki等[15]發(fā)現Kex2位點氨基酸的精氨酸替換并不能增強單寧酶AoTanA對Kex2蛋白酶的抗性結論不一致。通過對這2 個單寧酶結構分析,兩者的氨基酸一致性只有21%,這使得空間結構上存在差異。進一步分析發(fā)現單寧酶AoTanA中存在2 個Kex2位點(Lys310-Arg311,Lys315-Arg316),而單寧酶AfTanA僅存在1 個Kex2位點(Lys315-Arg316)。雖然它們全部處在LoopFK區(qū)域中,但是單寧酶AoTanA較單寧酶AfTanA長7 個氨基酸,這使得單寧酶AoTanA中的該區(qū)域暴露在蛋白的表面較多,更容易被Kex2蛋白酶所識別切割。突變菌株的發(fā)酵液中單寧酶活力較野生AfTanA提高了12%和22%左右,進一步說明Kex2位點的改造有利于單寧酶的發(fā)酵生產。

本課題組前期己對AfTanA進行了異源表達和性質測定,通過對比AfTanA、AfTanR316A和AfTanΔKR的酶性質發(fā)現,突變體和野生型單寧酶的酶學性質差異明顯。如單寧酶AfTanA的最適反應溫度為40 ℃,而兩種突變體最適反應溫度均為20 ℃,由常溫酶轉變?yōu)榈蜏孛竅22]。大部分己報道的單寧酶最適反應溫度范圍為30～60 ℃,最適pH值為5.0～6.0,單寧酶活力能夠穩(wěn)定的pH值范圍為3.0～8.0[23-24]。Fuentes等[25]從黑曲霉GH1中首次獲得了嗜冷單寧酶,而隨后鮮有低溫單寧酶的報道。本研究分析造成反應溫度發(fā)生改變的原因,很可能是由于野生型單寧酶AfTanA中2 個亞基(Kex2蛋白酶切割產物)通過C202-C502間的二硫鍵連接,而突變后的兩蛋白片段是由高鍵能的肽鍵所連接,同時精氨酸的缺失使得結構中的次級鍵數目大大減少,繼而該區(qū)域柔性增強,更有利于酶適應低溫的反應條件[26]。因此,K315-R316位點可以作為溫度突變體相關研究的選擇位點。參考己報道單寧酶的晶體結構可知,單寧酶AftanA可以分為“Lid”和“Catalytic”2 個模塊,并且具有保守的“CS-D-HC”序列,相似的結構也出現在脂肪酶中[27]。本研究單寧酶AfTanA中的Kex2位點(K315-R316)位于“Lid”模塊LoopFK區(qū)域中,該區(qū)域與酶的催化效率和穩(wěn)定性有較大相關性。Xiao Xunjun等[28]研究發(fā)現脂肪酶中的“Lid”模塊雖然不是酶的催化區(qū)域,但是在底物的接合和產物的釋放過程中發(fā)揮著重要作用。Johnson等[29]在探究磷酸烯醇丙酮酸羧激酶中的“Lid”模塊中的Loop結構功能時,同樣發(fā)現該結構與酶的催化效率有很大相關性。因此,Kex2酶切位點(K315-R316)對AftanA酶學性質的影響,很可能該位點所處的Loop區(qū)域結構的特性所造成的[30],而內在的分子機制還需進一步探明。

經對突變體和野生型單寧酶在柿子汁的應用對比分析發(fā)現,Kex2位點(K315-R316)的單點替換突變AfTanR316A和雙點缺失突變AfTanΔKR對柿子中多酚物質(單寧)的降解能力并未發(fā)生改變,具有野生型單寧酶相同的應用效果。

本研究通過對單寧酶AfTanA中Kex2蛋白酶位點(K315-R316)對酶性質的影響分析,明確該位點對于酶的催化效率和穩(wěn)定性影響較大,雙點的缺失突變AfTanΔKR單寧酶表現出更加優(yōu)良的酶學特性,具有在食品工業(yè)中發(fā)揮巨大作用的潛力。