基于菌株水平腸道內(nèi)植物乳桿菌定性定量研究方法的建立

姜帥銘,馬臣臣,游政凱,張家超

(海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南 ?？?570228)

隨著近年對(duì)益生菌[1]研究的不斷深入,益生菌在醫(yī)學(xué)、食品行業(yè)以及畜牧業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[2-3],而益生菌的主要作用靶點(diǎn)便是腸道,在近十年里對(duì)腸道微生物的認(rèn)知更是有了極大提高。腸道微生物數(shù)量龐大,基因數(shù)量大約是人類基因組數(shù)量的100 倍[4],這些微生物的結(jié)構(gòu)和組成同時(shí)影響著宿主的營養(yǎng)加工、免疫功能、胃腸道發(fā)育及其他多種生理活動(dòng)[5-6],且可以通過飲食、手術(shù)或抗生素人為干預(yù)改變[7]。腸道微生物的失衡與各類疾病有著千絲萬縷的聯(lián)系,如腎臟疾病[8]、代謝疾病[9]、心血管疾病[10]及神經(jīng)疾病[11]等。目前,腸道成為了預(yù)測疾病甚至干預(yù)疾病的新“靶點(diǎn)”[12],而益生菌更是成為塑造微生物群落組成和功能、預(yù)治疾病的“新工具”。

雙歧桿菌和乳桿菌為最常見的益生菌菌屬[13],其中,屬于乳桿菌屬的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),具有免疫調(diào)節(jié)、降低血清膽固醇含量、抑制動(dòng)脈粥樣硬化、維持腸道內(nèi)菌群平衡[14]、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收及緩解乳糖不耐癥等功能[15]。而益生菌是否真正發(fā)揮益生作用還要基于菌株水平進(jìn)行考量,L. plantarum ZDY04菌株可以通過調(diào)節(jié)小鼠中Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae、Bacteroidaceae科和Mucispirillum屬的相對(duì)豐度,顯著降低血清氧化三甲胺和盲腸三甲胺水平,從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化[16]。Malik等[17]對(duì)20 例冠心病患者每日補(bǔ)充L. plantarum菌株299v持續(xù)6 周,發(fā)現(xiàn)可改善患者冠心病血管內(nèi)皮功能、降低炎癥。L. plantarum P8被證明可緩解壓力和焦慮,改善記憶認(rèn)知[18]。以上研究對(duì)L. plantarum益生功效的研究都基于菌株水平進(jìn)行評(píng)估。而益生菌是否能夠活著進(jìn)入腸道,并在其中發(fā)揮作用,甚至定植于腸道[19],是判斷益生菌是否具有益生功效的主要標(biāo)準(zhǔn)。

鑒于目前業(yè)界對(duì)菌株水平益生菌功效評(píng)價(jià)的共識(shí)[20-22],在開展腸道內(nèi)益生菌相關(guān)研究時(shí),需要基于菌株水平對(duì)其進(jìn)行定性定量分析,定性判斷是否活著進(jìn)入腸道,定量判斷是否達(dá)到一定劑量。目前基于菌株水平對(duì)益生菌在腸道內(nèi)定性和定量評(píng)價(jià)相關(guān)研究報(bào)道仍較匱乏,也尚未建立合理有效的評(píng)價(jià)方法。而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法效率低且無法從外觀形態(tài)鑒定到菌株水平,因此建立對(duì)益生乳桿菌基于菌株水平的定性定量分析方法尤為重要。

本研究以1 株具有潛在益生功效的L. plantarum HNU082為例,對(duì)其在菌株水平上基于腸道定性以及定量分析,建立宿主腸道內(nèi)L. plantarum HNU082菌株水平的定性定量研究方法,每個(gè)菌株都具有自己獨(dú)特的基因特征,這也是從腸道內(nèi)能夠?qū)⒃摼暾业降睦碚撘罁?jù)[23]。首先從基因?qū)用嬲业皆摼晏禺愋云?設(shè)計(jì)特異性引物,同時(shí)注釋抗生素相關(guān)抗性基因,并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,找到其能耐受的抗生素及最小耐受濃度[24],利用抗生素對(duì)糞便中的微生物進(jìn)行第一步篩選,并分離篩選疑似菌落,而后用特異性引物擴(kuò)增該菌株用于在腸道水平上的定性,并通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)定量分析。real-time PCR用于特定基因片段的定量研究己經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道,有一定的準(zhǔn)確性[25]。最后用實(shí)例對(duì)該定性定量方法驗(yàn)證。本研究旨在建立完善宿主腸道內(nèi)L. plantarum HNU082定性定量研究方法,為腸道內(nèi)對(duì)益生菌的益生功效評(píng)價(jià)以及益生菌產(chǎn)品功效評(píng)價(jià)提供新的衡量指標(biāo),也將為益生乳桿菌的體內(nèi)研究方法提供重要理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L. plantarum HNU082于2016年分離自海南特色發(fā)酵魚茶樣本[26],23 種參考菌株分離自海南特色發(fā)酵蔬菜[27]及海南特色發(fā)酵海產(chǎn)品樣本中[28],保藏于海南大學(xué)食品學(xué)院熱帶有益微生物菌種資源庫,用于特異性引物篩選。

MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;諾氟沙星、鹽酸克林霉素、紅霉素、羅紅霉素、鹽酸四環(huán)素、氧四環(huán)素、鹽酸萬古霉素、羧芐青霉素鈉、頭孢唑啉鈉、氯霉素、利福平 北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、酚、乙酸鈉(均為分析純) 廣州化學(xué)試劑廠;甲醇、異丙醇、硼酸、氯仿、異戊醇(均為分析純) 西隴科學(xué)股份有限公司;6×DNA loading buffer 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;2×Taq Master Mix 南京諾唯贊生物科技有限公司;核酸染料(Goldview) 美國Amerco公司;瓊脂糖北京天根生化科技有限公司;瓊脂 上海百賽生物技術(shù)有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)上海吉至生化科技有限公司;pUC-T TA cloning kit北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A300 Fast Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1C標(biāo)準(zhǔn)型雙人凈化工作臺(tái) 蘇州蘇凈集團(tuán)公司;DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠;FA-1604電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;AlphaImage HP型Cell Biosciences凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司;UV759紫外-可見分光光度計(jì)上海奧譜勒儀器有限公司;G154DW高壓蒸汽滅菌鍋廈門致微儀器有限公司;FST-RO精密型超純水機(jī) 普利菲爾應(yīng)用材料有限公司;85-1恒溫磁力攪拌器 常州澳華儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;StepOne Plus real-time PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;G20電動(dòng)組織研磨器 生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1L.plantarumHNU082定性分析

1.3.1.1L.plantarumHNU082基因水平分析

采用CTAB凍融法提取菌株DNA[29],并溶于TE(Tris-EDTA)緩沖液中,于-80 ℃保存,而后送樣至上海美吉生物有限公司進(jìn)行單分子PacBio測序分析,經(jīng)過質(zhì)控拼接后組裝并進(jìn)行基因預(yù)測,并與抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),找到其存在的抗生素抗性基因,注釋后選取對(duì)應(yīng)抗生素進(jìn)行驗(yàn)證。與23 株NCBI數(shù)據(jù)庫中己鑒定且有完整基因序列的L.plantarum進(jìn)行同源基因聚類,找到L.plantarumHNU082特有的特異性片段用于特異性引物設(shè)計(jì)。

1.3.1.2 特異性片段設(shè)計(jì)及定性分析

同源基因聚類找到L.plantarumHNU082的特異性片段,通過Primer軟件設(shè)計(jì)特異性引物,并利用實(shí)驗(yàn)室保存的其他菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。經(jīng)引物設(shè)計(jì)、驗(yàn)證等過程,選用A7作為HNU082的特異性引物,上游引物序列5’-TGTTTCGGTTAGATAGCGTGTC-3’,下游引物序列5’-TTAGCCCAACTACCTTCCTG-3’,擴(kuò)增片段長度190 bp。反應(yīng)體系50 μL:1 μL DNA模板,1 μL上游引物,1 μL下游引物,20 μLTaqMix,27 μL dd H2O。PCR條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,62 ℃退火45 s,72 ℃延伸20 s,循環(huán)26 次;72 ℃末端延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。

1.3.2L.plantarumHNU082定量分析

1.3.2.1L.plantarumHNU082基因水平分析

實(shí)驗(yàn)步驟同1.3.1.1節(jié)。

1.3.2.2 real-time PCR和定量反應(yīng)系統(tǒng)特異性評(píng)定

在ABI StepOne Plus real-time PCR儀上以待測樣本DNA為模板,進(jìn)行L.plantarumHNU082特異性引物的PCR擴(kuò)增和檢測。擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性20 s;94 ℃變性5 s,58 ℃退火35 s,72 ℃延伸50 s,循環(huán)40 次。將溶解曲線設(shè)定從60 ℃緩慢加熱至95 ℃,溫度每增加0.2 ℃檢測一次信號(hào)強(qiáng)度,進(jìn)行連續(xù)熒光采集,得到熔融曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. plantarum HNU082全基因組水平分析

對(duì)菌株全基因組進(jìn)行測序及基因預(yù)測(表1),該菌株基因組由1 條染色體和4 個(gè)質(zhì)粒組成。染色體長度為3 303 679 bp,總GC含量為44.51%,共編碼3 203 個(gè)開放閱讀框。該菌株基因組編碼了豐富的碳水化合物代謝基因和磷酸轉(zhuǎn)移酶基因復(fù)合體,這些特點(diǎn)有利于該菌株在營養(yǎng)限制的環(huán)境中生長,也有利于該菌株在腸道內(nèi)參與碳水化合物競爭時(shí)更具優(yōu)勢。

表1 基因預(yù)測結(jié)果Table 1 Gene prediction results

文獻(xiàn)中己經(jīng)測序全基因組L.plantarum的平均基因組大小約為3 200 kb,編碼基因數(shù)量為3 000 個(gè)左右,平均GC含量為44.5%左右[30]。本實(shí)驗(yàn)所用參考菌株的基因組大小,編碼基因數(shù)量更為豐富,而GC含量與其他NCBI中己鑒定的L.plantarum菌株基本一致。

圖1 L. plantarum HNU082基因組圖Fig. 1 Genome-wide map of L. plantarum HNU082

根據(jù)基因預(yù)測結(jié)果,用Circos v0.64軟件繪制基因組圈圖(圖1)。圈圖的最外圈為基因組大小的標(biāo)識(shí),每一個(gè)刻度為0.1 Mb;第2圈和第3圈為正鏈、負(fù)鏈上的編碼區(qū),不同顏色表示編碼區(qū)不同的COG(clusters of orthologous groups of proteins)功能分類;第4圈為rRNA和tRNA;第5圈為GC含量,向外的紅色部分表示該區(qū)域GC含量高于全基因組平均GC含量,峰值越高表示與平均GC含量差值越大,向內(nèi)的藍(lán)色部分表示該區(qū)域GC含量低于全基因組平均GC含量,峰值越高表示與平均GC含量差值越大;最內(nèi)一圈為GC skew值,即為(G-C)/(G+C),在生物意義上該值為正值時(shí)正鏈越更傾向于轉(zhuǎn)錄編碼區(qū),為負(fù)值時(shí)負(fù)鏈更傾向于轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)。

2.2 抗性基因注釋與驗(yàn)證

將L.plantarumHNU082的拼接序列與抗性基因數(shù)據(jù)庫CARD(Comprehensive Antibiotic Research Database)比對(duì),注釋抗性基因并選取對(duì)應(yīng)抗生素驗(yàn)證結(jié)果,由圖2可見,L.plantarumHNU082對(duì)萬古霉素及諾氟沙星的耐受性較好,最大耐受質(zhì)量濃度可達(dá)到1 280 μg/mL,經(jīng)平板驗(yàn)證后選取萬古霉素與諾氟沙星作為屏蔽腸道中其他微生物的抗生素,具體驗(yàn)證過程見文獻(xiàn)[24]。

圖2 培養(yǎng)12 h不同抗生素濃度下L. plantarum HNU082吸光度Fig. 2 Absorbance of L. plantarum HNU082 with different concentrations of antibiotics after culture for 12 hours

多數(shù)乳酸菌都存在對(duì)萬古霉素的先天性抗性基因,L.plantarum的細(xì)胞壁上一種五肽末端的D-丙氨酸殘基被D-乳酸或D-絲氨酸取代,而D-乳酸或D-絲氨酸對(duì)糖肽類抗生素產(chǎn)生耐藥性,阻止了萬古霉素的結(jié)合,從而使菌株對(duì)萬古霉素產(chǎn)生抗性[31]。因此,抗生素的選用只能殺滅部分糞便中的微生物,不能作為對(duì)糞便中L.plantarumHNU082定性篩選的指標(biāo)。糞便中微生物經(jīng)抗生素培養(yǎng)篩選后的單菌落仍需要特異性引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增鑒別。

2.3 特異性引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

首先從NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫選取與L.plantarumHNU082進(jìn)化距離相近的23 株L.plantarum,并下載完整基因序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行同源基因聚類,聚類結(jié)果如圖3所示,中間重疊的部分指24 株菌株共有的基因,每一片“花瓣”邊緣位置數(shù)字表示該菌株獨(dú)有的基因數(shù)量,L.plantarumHNU082與其他菌株相比具有大量菌株特異性片段。

圖3 同源基因聚類韋恩圖Fig. 3 Venn map of homologous gene clustering

以L.plantarumHNU082獨(dú)有的200 個(gè)基因片段為模板設(shè)計(jì)特異性引物,以實(shí)驗(yàn)室保存的L.plantarum提取的DNA為特異性檢測模板,以L.plantarumHNU082提取的DNA為陽性對(duì)照,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測方法的特異性。并利用實(shí)驗(yàn)室保存的L.plantarum進(jìn)行驗(yàn)證(圖4),L.plantarumHNU082在250 bp左右有明亮條帶,其他L.plantarum菌株在250 bp未出現(xiàn)明亮條帶,證明引物特異性良好,可用于腸道內(nèi)容物的定性研究。

圖4 特異性引物驗(yàn)證情況Fig. 4 Verification of the primer specificity

從菌株水平看,盡管各個(gè)菌株在種水平上進(jìn)化距離相近,但每一個(gè)菌株在基因水平上都會(huì)有其獨(dú)特的序列作為身份標(biāo)簽,需要找到該菌株獨(dú)特的序列,根據(jù)其設(shè)計(jì)大小合適的特異性引物用作腸道內(nèi)定性的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 L. plantarum HNU082 定量方法的建立

圖5 樣本擴(kuò)增溶解曲線Fig. 5 Dissociation curves of samples

以初始模板量為橫坐標(biāo)(X),Ct值為縱坐標(biāo)(Y),繪制出L.plantarumHNU082的real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,方程Y=-3.192X+38.536,建立的L.plantarumHNU082標(biāo)準(zhǔn)曲線符合real-time PCR的要求。為區(qū)分產(chǎn)物中的特異性產(chǎn)物以及非特異性產(chǎn)物,繪制了L. plantarum HNU082的擴(kuò)增熔解曲線,表示隨溫度升高DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度。從圖5可以看出,擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線一致,在82.74 ℃達(dá)到最高峰,且曲線都為單一峰形,證明熒光定量反應(yīng)的特異性良好,無特異性引物,可以用于L. plantarum HNU082的熒光定量。

2.5 腸道內(nèi)L. plantarum HNU082定性定量結(jié)果實(shí)例驗(yàn)證

對(duì)大鼠進(jìn)行為期4 周的灌胃,每周對(duì)糞便進(jìn)行采樣,停止灌胃后,仍在每周對(duì)糞便進(jìn)行采樣,持續(xù)到第8周。糞便分為2 份,一份用于定性分析,選用MRS乳酸菌限制性培養(yǎng)基混合萬古霉素及諾氟沙星對(duì)糞便進(jìn)行稀釋涂布,稀釋梯度選擇10-3～10-6,37 ℃培養(yǎng)24 h,對(duì)單菌落進(jìn)行特異性引物PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳圖譜驗(yàn)證,圖6為大鼠糞便中稀釋梯度為10-6時(shí),37 ℃培養(yǎng)24 h的菌落以及用特異性引物進(jìn)行菌落PCR后的凝膠電泳圖。從培養(yǎng)結(jié)果看,平板無明顯雜菌,菌落呈白色圓形凸起且邊緣整齊,符合乳桿菌屬形態(tài)特征,可見抗生素對(duì)雜菌的屏蔽效果較好,凝膠電泳圖可見膠板存在一條明亮條帶,可認(rèn)為是L. plantarum HNU082;另一份用于定量分析,提取糞便微生物總DNA,應(yīng)用real-time PCR的方法對(duì)L. plantarum HNU082進(jìn)行定量(圖7)。

圖6 L. plantarum HNU082定性分析結(jié)果Fig. 6 Qualitative analysis of L. plantarum HNU082

real-time PCR分析灌胃后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠糞便中L. plantarum HNU082數(shù)量[32],前4 周持續(xù)灌胃的同時(shí)檢測,如圖7所示,該菌株在第4周數(shù)量達(dá)到最大值,為(7.51±0.32)(lg(CFU/g))。而后停止灌胃,可以看出L. plantarum HNU082出現(xiàn)了明顯下降趨勢,而后數(shù)量穩(wěn)定在第8周,為(5.30±0.31)(lg(CFU/g))。由此可知real-time PCR用于L. plantarum HNU082的在腸道內(nèi)定量的方法可行。

圖7 灌胃后L. plantarumHNU082在腸道內(nèi)real-time PCR結(jié)果Fig. 7 Real-time PCR results of L. plantarum HNU082 in intestine after intragastric administration

3 結(jié) 論

本研究通過基因組層面設(shè)計(jì)菌株的特異性引物,并利用抗生素進(jìn)行第一步篩選,對(duì)分離出單菌落進(jìn)行特異性擴(kuò)增進(jìn)行定性分析,通過real-time PCR定量分析,建立了一種基于菌株水平對(duì)腸道內(nèi)L. plantarum定性定量的分析方法,并以L. plantarum HNU082為例進(jìn)行了驗(yàn)證,效果良好。本方法的建立在菌株層面從腸道水平對(duì)體內(nèi)的益生菌株含量進(jìn)行定性定量工作,適用于所有益生菌的相關(guān)定性定量研究,該方法可以從定義出發(fā),評(píng)價(jià)菌株是否能以一定劑量活著進(jìn)入腸道,達(dá)到益生菌的標(biāo)準(zhǔn),優(yōu)化益生菌市場,并作為評(píng)價(jià)指標(biāo)用于益生菌的益生功效評(píng)價(jià)以及多元化益生菌產(chǎn)品功能評(píng)價(jià)中,也將為益生乳桿菌的體內(nèi)研究方法提供重要理論支持,為益生菌類保健食品的產(chǎn)業(yè)技術(shù)的發(fā)展以及相關(guān)產(chǎn)業(yè)法律法規(guī)的制定提供參考指標(biāo),促進(jìn)我國益生菌產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。