等離子體活性水腌制對(duì)豬肉肌原纖維蛋白氧化及結(jié)構(gòu)的影響

孫克奎,金聲瑯,潘雅燕,王 燕

(黃山學(xué)院旅游學(xué)院,安徽 黃山 245041)

腌制是腌臘肉制品加工的關(guān)鍵工序,傳統(tǒng)的腌制方法包括干腌和濕腌法。干腌法是在肉的表面揉搓腌制混合物(主要是氯化鈉、硝酸鹽或亞硝酸鹽、糖和香料),濕腌法是將肉浸泡在鹽水里進(jìn)行腌制。近年來,己有腌制方法縮短了鹽漬時(shí)間,提高了腌臘肉制品鹽分布的均勻性,改善產(chǎn)品的外觀同時(shí)取代了亞硝酸鹽的添加,例如超聲波輔助腌制技術(shù)[1]、脈沖加壓輔助腌制技術(shù)[2]、介質(zhì)阻擋放電腌制技術(shù)[3]、等離子體活性水(plasmaactivated water,PAW)腌制技術(shù)[4]等。

大氣壓低溫等離子體作為一種新技術(shù),可以產(chǎn)生紫外光、電子、正負(fù)離子、原子、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)等活性物質(zhì)[5]。射流等離子體具有靈活多變的電極結(jié)構(gòu),通過在大氣壓下將電場和氣流共同作用迫使其放電產(chǎn)生的等離子體從其產(chǎn)生區(qū)域噴出,讓其產(chǎn)生的等離子體在外界開放的環(huán)境中朝著工作區(qū)域方向作定向移動(dòng),從而獲得大氣壓射流等離子體[6]。

通過腌制可以改善肉制品的風(fēng)味、多汁性和嫩度,并延長其保質(zhì)期。PAW作為一種新型、有前途的肉類加工技術(shù)己經(jīng)應(yīng)用于乳化腸的加工[4],從而取代亞硝酸鹽的添加,降低成本;也被應(yīng)用在豬肉脯的加工過程中[7],不僅可以改善產(chǎn)品顏色同時(shí)也可以降低亞硝酸鹽殘留量。本實(shí)驗(yàn)PAW由等離子體射流裝置處理純水制成,在制備過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性物質(zhì),這些成分可能會(huì)導(dǎo)致肉類肌原纖維蛋白質(zhì)的氧化以及結(jié)構(gòu)的變化[8]。所以,應(yīng)該考慮到這種加工工藝對(duì)促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)可能會(huì)產(chǎn)生的影響。

本實(shí)驗(yàn)考察不同處理時(shí)間制備的PAW腌制對(duì)豬肉肌原纖維蛋白氧化及結(jié)構(gòu)的影響,為PAW腌制技術(shù)在肉類腌制中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屠宰后48 h的黃山黑母豬背長肌,黃山黑豬日齡為6 個(gè)月左右,由黃山全江生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供;食鹽、白砂糖等配料 市售。

1.2 儀器與設(shè)備

CTP-2000K等離子體射流發(fā)生器 南京蘇曼等離子科技有限公司;IKA T25高速勻漿機(jī) 德國艾卡儀器設(shè)備有限公司;UV-2501分光光度計(jì) 日本島津公司;Allegra高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司;FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī) 中國思昊科技有限公司;Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher科技有限公司;L-8900氨基酸分析儀、F-7000熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 等離子體射流處理

圖1 等離子體射流放電裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the plasma jet discharge experimental setup

如圖1所示,在500 mL燒杯中,加入300 mL去離子水,用空氣作為載氣,流量為22.5 L/min,輸出電壓為20 kV,電流為0.025 mA,用等離子體射流裝置分別處理0、40、60 s和80 s。為保證液體樣品的一致性,防止鹽分及其他成分溶解對(duì)等離子體處理過程中樣品的干擾,實(shí)驗(yàn)中,先對(duì)去離子水進(jìn)行等離子體處理制備PAW,隨后將各處理組配制成相同濃度的腌制液。

1.3.2 樣品的腌制

腌制液的制備:等離子體處理后,在PAW和純水中分別加入8% NaCl、3%白糖、0.5%焦磷酸鈉,配制成腌制液。其中一組用未處理組腌制液腌制,為對(duì)照組(n=10),另3 組分別為40、60 s和80 s等離子體射流裝置處理制備的PAW腌制液處理組(n=90)。每組豬里脊樣品在10 ℃環(huán)境中腌制12 h,腌制液和肉塊的質(zhì)量比為2∶1,全部樣品腌制后立即取出并用濾紙吸干表面,真空包裝后在-20 ℃冷凍貯藏備用。

1.3.3 肌原纖維蛋白的提取

根據(jù)汪媛等[9]的方法并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷摹７Q取5 g腌制后的樣品進(jìn)行攪碎,將3 g肉糜加入到30 mL磷酸緩沖液(100 mmol/L磷酸鹽緩沖液、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA,pH 7.0)中勻漿(10 000 r/min,1 min),隨后將制得的懸浮液進(jìn)行高速冷凍離心(10 000×g,15 min,4 ℃),棄去上清液,收集沉淀。將沉淀用相同的緩沖液沖洗3 次。再將沉淀溶解到4 倍體積的20 mmol/L磷酸緩沖液中(0.7 mol/L KI、0.02% NaN3,pH 7.0),用相同條件離心,收集沉淀即為肌原纖維蛋白。隨后將沉淀溶解在20 mmol/L磷酸緩沖液中(0.1 mol/L NaCl,pH 7.0),采用雙縮脲法測定肌原纖維蛋白溶液濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線:吸取10 mg/mL的牛血清蛋白0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,分別用超純水補(bǔ)充至1 mL,加入4 mL雙縮脲試劑劇烈振蕩后在室溫下靜置30 min,于波長540 nm處測定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo),牛血清蛋白濃度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品蛋白濃度測定:肌原纖維蛋白溶液用0.5 mol/L NaOH溶液稀釋5 倍后,取1 mL稀釋液于試管中與4 mL雙縮脲試劑混合,隨后在波長540 nm處測定吸光度,測定肌原纖維蛋白濃度。吸取每組分中部分肌原纖維蛋白溶液于-20 ℃冰箱中預(yù)凍12 h,過后于冷阱溫度-40 ℃,真空度低于40 Pa條件下進(jìn)行抽真空冷凍干燥24 h,得到肌原纖維蛋白粉末,用于傅里葉變換紅外光譜分析。

1.3.4 PAW腌制后蛋白氧化水平測定

1.3.4.1 蛋白質(zhì)羰基含量測定

采用賈娜等[10]的方法。取各處理組的豬肉樣品1 g切碎后,在10 mL焦磷酸緩沖液(含2 mmol/L Na2P4O7、10 mmol/L Tris-maleate、100 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2和2 mmol/L EGTA,pH 7.4)中均質(zhì)15 s。隨后加入1 mL 20%三氯乙酸溶液到200 μL均質(zhì)液中,離心5 min(4 ℃,12 000×g)。沉淀用10%三氯乙酸溶液清洗后離心5 min(4 ℃,12 000×g),隨后去除懸浮液,在蛋白沉淀中加入1 mL 2,4-二硝基苯肼溶液(2,4-二硝基苯肼溶解于2 mol/L HCl溶液中,濃度為10 mmol/L),空白對(duì)照組加入1 mL 2 mol/L HCl溶液,在室溫下避光反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后,相同條件離心,棄去上清液,加入1 mL 20%三氯乙酸沉淀蛋白。用1 mL乙酸乙酯-乙醇(1∶1,V/V)溶液沖洗沉淀3 次,去除2,4-二硝基苯肼。提取后,將沉淀溶解于1 mL含有6 mol/L鹽酸胍的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中,37 ℃振蕩30 min。再用相同條件離心后取上清液于波長370 nm處測定吸光度。蛋白質(zhì)羰基摩爾吸光系數(shù)為22 000 L/(mol·cm),以鹽酸胍溶液為空白調(diào)零,HCl為對(duì)照組,結(jié)果以每毫克蛋白所含的羰基物質(zhì)的量表示(nmol/mg)。

1.3.4.2 總巰基含量測定

采用Ellman試劑進(jìn)行測定[11]。將4.5 mL含有8 mol/L尿素,10 mmol/L EDTA和0.6 mol/L KCl(pH 8.0)的溶液加入到0.5 mL肌原纖維蛋白溶液(5 mg/mL)中,再加入100 μL 5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)反應(yīng)液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 7.0)。在室溫(25 ℃)條件下孵育25 min,使硫醇基與5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)反應(yīng),隨后在4 ℃,12 000×g離心5 min,在波長412 nm處測定上清液吸光度。總巰基含量用摩爾消光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果以每毫克蛋白所含的巰基物質(zhì)的量表示(nmol/mg)。

1.3.5 游離氨基酸含量測定

采用Lorenzo等[12]的方法從腌制后的肉中提取游離氨基酸。分別將2 g不同處理組的肉干在25 mL的三氯乙酸中靜置1 h,隨后吸取5 mL溶液用0.45 μm過濾膜過濾。用L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)濾液進(jìn)行定性和定量分析。每個(gè)樣品的游離氨基酸含量重復(fù)測定3 次。游離氨基酸含量以干物質(zhì)表示(mg/100 g)。

1.3.6 表面疏水性測定

采用1-苯氨基-8-萘磺酸鹽(1-anilino naphthalene-8-sulfonic acid,ANS)熒光探針法測定蛋白質(zhì)表面疏水性[13]。將提取的肌原纖維蛋白在磷酸鹽緩沖液中(含0.01 mmol/L K2HPO4,pH 7.0)按2 倍梯度稀釋至質(zhì)量濃度0.5～5 mg/mL。每個(gè)質(zhì)量濃度取2 mL與25 μL 8 mmol/L ANS溶液(含0.1 mmol/L NaH2PO4緩沖溶液,pH 6.0)混合,在25 ℃條件下暗置孵育25 min。采用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長374 nm、發(fā)射波長485 nm處測定每個(gè)蛋白質(zhì)量濃度的熒光強(qiáng)度,不加ANS的為空白對(duì)照組。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

將2 mg肌原纖維蛋白粉末和100 mg KBr混合后,用研缽研磨成均勻粉末,壓制成薄片。用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm-1之間進(jìn)行掃描,光譜分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)為128 次[14]。采用OMNICTM軟件(Thermo Nicolet Inc., IL, USA)對(duì)酰胺I波段(1 700～1 600 cm-1)區(qū)域進(jìn)行分析。參考Kong Jilie等[15]的方法評(píng)價(jià)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,每種二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量表示為各峰面積占總酰胺I帶峰面積的百分比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)對(duì)不同處理組進(jìn)行單因素方差分析。采用Duncan多重比較法對(duì)不同處理組均值進(jìn)行顯著性分析(P＜0.05)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,每一次取3 個(gè)樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),以保證準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAW腌制對(duì)蛋白質(zhì)氧化程度的影響

羰基是評(píng)定肉類中蛋白質(zhì)氧化程度最常用的指標(biāo),通常由氨基酸殘基側(cè)鏈氧化而成[16]。通過測定肌原纖維蛋白羰基和總巰基含量,研究PAW處理對(duì)蛋白質(zhì)的氧化的影響。由圖2可以看出,蛋白質(zhì)的羰基含量隨著等離子體處理時(shí)間的延長而顯著增加(P＜0.05),40、60 s和80 s處理組羰基含量分別比對(duì)照組增加0.67、1.42 nmol/g和1.57 nmol/g?？赡艿脑蚴荘AW中含有大量的高能粒子以及活性氧和活性氮自由基(ROS和RNS)[17],ROS和RNS可以氧化氨基酸殘基側(cè)鏈,尤其是側(cè)鏈上有NH-或NH2基團(tuán)的氨基酸,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化[18]。隨著處理時(shí)間的延長,ROS和RNS含量上升導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化程度上升。有研究表明,芳香型和含硫氨基酸側(cè)鏈極容易被氧化[19],由圖2可知,PAW處理后的總巰基含量逐漸下降,40、60 s和80 s處理組總巰基含量分別比對(duì)照組下降14.51%、19.35%和30.65%,說明PAW處理能夠促進(jìn)半胱氨酸巰基基團(tuán)的損失,巰基基團(tuán)的減少意味著二硫鍵的形成,從而導(dǎo)致磺酸的產(chǎn)生,同時(shí)半胱氨酸支鏈的硫醇基容易脫氫,導(dǎo)致(2Cys-2H)H+的形成,可以進(jìn)一步被氧化成磺基(—SO3)[20]。

圖2 PAW處理對(duì)蛋白質(zhì)羰基和總巰基含量的影響Fig. 2 Effect of PAW treatment on carbonyl and total sulfhydryl contents of myofibrillar protein

2.2 PAW腌制對(duì)游離氨基酸含量的影響

表1 PAW處理對(duì)游離氨基酸含量的影響Table 1 Effect of PAW treatment on free amino acid contents

由表1可知,相對(duì)于對(duì)照組,40 s處理組的游離氨基酸總量顯著下降,這可能由于游離巰基被氧化成二硫鍵導(dǎo)致蛋白質(zhì)出現(xiàn)大量的聚集相關(guān)[21]。而60 s和80 s處理組的游離氨基酸總量顯著上升(P＜0.05),表明長時(shí)間處理可能破壞二硫鍵,從而加速了部分蛋白質(zhì)降解為游離氨基酸組分。疏水性氨基酸的含量呈現(xiàn)相似的趨勢,這可能與蛋白質(zhì)的不斷氧化增加了蛋白質(zhì)表面的疏水性有關(guān)[22]。與甜味相關(guān)的氨基酸如丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和甘氨酸;以及與成熟風(fēng)味相關(guān)的賴氨酸、酪氨酸、天冬氨酸均隨著處理時(shí)間的延長呈上升趨勢。60 s和80 s處理組中與鮮味相關(guān)的谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸和精氨酸含量顯著大于對(duì)照組,說明60 s和80 s處理組有助于改善產(chǎn)品的滋味。

2.3 PAW腌制對(duì)蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

圖3 PAW處理對(duì)蛋白質(zhì)表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of PAW treatment on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

如圖3所示,蛋白質(zhì)表面疏水性可以用來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的變性情況[23]。相對(duì)于對(duì)照組,40 s處理組的疏水性指數(shù)顯著下降,可能是低氧化程度會(huì)引起蛋白質(zhì)重新折疊,團(tuán)聚阻礙了非極性氨基酸暴露于蛋白質(zhì)表面[24];然而隨著處理時(shí)間的延長,蛋白質(zhì)疏水性指數(shù)顯著增加,60 s和80 s處理組疏水性指數(shù)分別增加12.72%和36.36%,這可能是由于PAW腌制后,蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的拉伸和展開使構(gòu)象結(jié)構(gòu)變得松散和不穩(wěn)定[25],導(dǎo)致埋在蛋白質(zhì)的內(nèi)部原先被非極性環(huán)境包圍的疏水基團(tuán),暴露在水環(huán)境中,使得更多的ANS可以結(jié)合蛋白分子的非極性部分,從而增加表面疏水性[26]。PAW處理結(jié)果表明,隨著等離子體處理時(shí)間的延長,蛋白質(zhì)的展開量也可能增加,從而使疏水性基團(tuán)的暴露量增加,這與疏水性氨基酸結(jié)果一致。隨著等離子體處理時(shí)間的延長,PAW中越來越多的ROS自由基和羥自由基對(duì)疏水性氨基酸的攻擊也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的增加[27]。

2.4 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

如圖4所示,酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)的吸光光譜可以反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息,α-螺旋位于1 646～1 664 cm-1,β-折疊位于1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1,β-轉(zhuǎn)角位于1 664～1 681 cm-1,而1 637～1 645 cm-1對(duì)應(yīng)無規(guī)卷曲[28]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)PAW腌制處理后,雖然蛋白質(zhì)各組分的峰位沒有明顯的變化,但其部分區(qū)域受到PAW處理的影響,酰胺I帶變化明顯,尤其是80 s處理組圖譜比其他處理組圖譜更加平坦。通過二階求導(dǎo)去卷積技術(shù)對(duì)酰胺I帶進(jìn)行處理,并用PeakFit 4.12軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)對(duì)各處理組肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行曲線擬合分析得到不同處理組中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組分的相對(duì)含量,如圖5所示。與對(duì)照組相比,40、60、80 s處理組的α-螺旋相對(duì)含量分別減少了10.73%、20.71%和33.32%,而β-折疊相對(duì)含量增加了7.78%、11.87%和16.41%,無規(guī)卷曲相對(duì)含量增加了6.50%、17.38%和26.23%,β-轉(zhuǎn)角組無顯著變化。α-螺旋相對(duì)含量與蛋白質(zhì)的水合能力相關(guān),α-螺旋含量的降低可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性的增加,α-螺旋結(jié)構(gòu)的解旋會(huì)導(dǎo)致分子間相互作用的變化[29]。隨著處理強(qiáng)度的增加,肌原纖維蛋白的展開會(huì)使非極性氨基酸暴露在蛋白表面從而增加蛋白質(zhì)表面疏水性,這與2.2節(jié)結(jié)果一致。β-折疊含量的增加與PAW腌制過程產(chǎn)生的氧化體系相關(guān)[22],這可能導(dǎo)致肉蛋白質(zhì)的聚合。α-螺旋的穩(wěn)定性主要由多肽鏈中羰基氧(—CO)和氨基氫(NH—)之間的氫鍵維持,PAW中的ROS和RNS會(huì)破壞維持α-螺旋穩(wěn)定的氫鍵[30],從而引起α-螺旋含量下降,β-折疊和無規(guī)卷曲含量的上升。這些結(jié)果表明PAW處理能改變肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖4 肌原纖維蛋白酰胺I帶去卷積傅里葉變換紅外圖譜Fig. 4 Deconvoluted amide I FTIR spectra of myofibrillar protein

圖5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化Fig. 5 Changes in relative contents of secondary structures of myofibrillar protein

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用等離子體射流裝置制備的PAW作為一種新型腌制工藝腌制豬背最長肌。相比對(duì)照組,PAW腌制組的蛋白質(zhì)羰基含量顯著增加,巰基含量顯著減少(P＜0.05),說明蛋白質(zhì)的氧化程度加劇。隨著處理時(shí)間的延長,60 s和80 s處理組的游離氨基酸總量顯著增加(P＜0.05),尤其是呈味氨基酸含量的增加,有利于滋味的形成;PAW處理組疏水性氨基酸的變化趨勢與蛋白質(zhì)表面疏水性的變化趨勢一致,說明60 s和80 s處理組會(huì)破壞蛋白質(zhì)的二硫鍵。隨著處理時(shí)間的延長,樣品中α-螺旋發(fā)生解旋,β-折疊組分增加,說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸展開,由緊密變松散,有助于暴露肌原纖維蛋白中的疏水基團(tuán)。綜上所述,PAW腌制能促使豬肉肌原纖維蛋白發(fā)生氧化同時(shí)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu);PAW腌制能夠作為一種新型的腌制方法應(yīng)用于肉制品的加工過程中,但目前低溫等離子體技術(shù)在食品方面的應(yīng)用研究仍處于探索階段,PAW對(duì)肉制品風(fēng)味品質(zhì)的影響還有待進(jìn)一步研究。