產(chǎn)前超聲診斷胎兒房室間隔缺損及基因檢測(cè)分析

谷孝艷，楊喜惠，郝曉艷，張 燁，孫 琳，韓建成，劉曉偉，何怡華*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院超聲科 胎兒心臟病母胎醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；2.中國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)婦幼保健院超聲科，新疆 烏魯木齊 830001)

房室間隔缺損(artioventricular septal defect, AVSD)是心內(nèi)膜墊發(fā)育異常導(dǎo)致的一組心臟畸形，在活產(chǎn)兒中的發(fā)生率為0.024%～0.031%[1]。目前產(chǎn)前AVSD檢出率已達(dá)57%～92%[2-3]。AVSD常與染色體異常相關(guān)，尤其唐氏綜合征，其在唐氏綜合征患兒中的發(fā)生率比染色體正常兒童高1 000倍。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)胎兒AVSD遺傳學(xué)檢測(cè)不再局限于染色體水平，可有更多、更精準(zhǔn)的發(fā)現(xiàn)，如單基因突變。本研究評(píng)估胎兒AVSD的分型及其合并心內(nèi)及心外畸形，并以二代測(cè)序技術(shù)低深蓋度全基因組測(cè)序及全外顯子測(cè)序檢測(cè)AVSD基因的特征。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2013年9月—2017年6月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院超聲產(chǎn)前檢查資料，孕婦年齡21～35歲，平均(28.3±3.5)歲；共21 179胎，孕周為16～37周，平均(25.0±5.9)周；共診斷150胎AVSD，47胎具有遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果。

1.2 儀器與方法 采用GE Voluson E8/E10彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行胎兒超聲心動(dòng)圖檢查，頻率4～8 MHz 2D/3D容積探頭，按美國(guó)超聲心動(dòng)圖協(xié)會(huì)胎兒超聲心動(dòng)圖檢查指南進(jìn)行規(guī)范化操作。由2名具有5年以上超聲心動(dòng)圖診斷經(jīng)驗(yàn)的副主任醫(yī)師分析圖像，評(píng)估AVSD分型及其合并畸形。

以DP318基因組提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)。取引產(chǎn)胎兒臍帶組織，同時(shí)抽取父母外周靜脈血各5 ml(乙二胺四乙酸抗凝)，即刻置于-80°C冰箱冷凍，并送檢進(jìn)行低深度全基因組測(cè)序及全外顯子測(cè)序。按照試劑盒步驟說(shuō)明提取胎兒臍帶組織的基因組DNA(gDNA)?；驕y(cè)序分2步完成：先以低深度全基因組測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq 2500，檢測(cè)100 kb以上的拷貝數(shù)變異，對(duì)檢出的染色體異常進(jìn)行注釋?zhuān)⒏鶕?jù)DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、Decipher(https://decipher.sanger.ac.uk/)、OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析檢出的變異；之后采用全外顯子組測(cè)序序列捕獲技術(shù)測(cè)序，捕捉全基因組外顯子區(qū)域DNA，富集后進(jìn)行外顯子目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序(Illumina Hiseq 2500，測(cè)序類(lèi)型:PEl00 bp)，對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行低質(zhì)量過(guò)濾，采用標(biāo)準(zhǔn)生物信息分析流程檢測(cè)單核苷酸變異和小的插入缺失，對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行檢出、過(guò)濾和注釋。變異位點(diǎn)過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)包括人群數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率(ExAC或千人基因組)<5%、最小覆蓋深度為10 X，變異功能變化(非同義突變、剪切位點(diǎn)變化、無(wú)義突變、移碼突變等)等。最終對(duì)變異的家系進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

以上檢查均經(jīng)孕婦及家屬同意，并簽署引產(chǎn)胎兒生物標(biāo)本提取及遺傳學(xué)檢測(cè)知情同意書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)前超聲心動(dòng)圖 47胎AVSD中，7胎(7/47,14.89%)為部分型AVSD，2胎(2/47,4.26%)為過(guò)渡型AVSD，38胎(38/47,80.85%)為完全型AVSD(圖1)。38胎完全型AVSD中，10胎(10/38，26.32%)為非均衡型AVSD，28胎(28/38，73.68%)為均衡型AVSD。

圖1 孕婦30歲，妊娠24周，胎兒完全型AVSD A.胎兒超聲心動(dòng)圖四腔心切面圖示十字交叉消失(RA:右心房；RV:右心室；LA:左心房；LV:左心室)； B.彩色多普勒?qǐng)D像示共同房室瓣反流

13胎(13/47，27.66%)合并單純心內(nèi)畸形，5胎(5/47，10.64%)合并單純心外畸形，14胎(14/47，29.79%)合并心內(nèi)及心外畸形，15胎(15/47，39.91%)無(wú)合并心內(nèi)及心外畸形。共27胎存在心內(nèi)畸形(27/47，57.45%)，其中23胎(23/27，85.19%)錐干系統(tǒng)畸形，包括11胎右室雙出口(11/23，47.83%)、4胎(4/23，17.39%肺動(dòng)脈閉鎖)、2胎肺動(dòng)脈狹窄(2/23，8.70%)、4胎大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位(4/23，17.39%)、1胎左肺動(dòng)脈懸吊(1/23，4.35%)和1胎共同動(dòng)脈干(1/23，4.35%)；2胎肺靜脈畸形引流(2/27，7.41%)，2胎主動(dòng)脈縮窄(2/27，7.41%)。

47胎AVSD中，18胎完全型AVSD、1胎部分型AVSD，共19胎合并心外畸形(19/47，40.43%)，包括內(nèi)臟異位17胎(17/19，89.47%)和頭部淋巴管囊腫(1/19，5.26%)及雙手足內(nèi)翻并多指/趾畸形各1胎(1/19，5.26%)。

2.2 基因檢測(cè) 對(duì)47胎臍帶組織提取DNA建庫(kù)，其中4胎組織降解。43胎接受低深度全基因組測(cè)序及全外顯子測(cè)序，結(jié)果顯示22胎(22/43，51.16%)基因陽(yáng)性，包括11胎21三體，2胎18三體(圖2)，1例13三體，2胎染色體大片段重復(fù)，6胎單基因突變。單基因突變包括CCDC14、EVC、PQBP1、ZFPM2、ARMC4、DNAH11。

圖2 孕婦30歲，妊娠24周，胎兒完全型AVSD A.胎兒臍帶組織低深度全基因組測(cè)序分析電子核型圖示18號(hào)染色體大片段重復(fù)； B.胎兒臍帶組織低深度全基因組測(cè)序結(jié)果示意圖示18號(hào)染色體拷貝數(shù)明顯增多

27胎AVSD合并心內(nèi)畸形，其中11胎(11/27，40.74%)基因檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；19胎AVSD合并心外畸形，其中15胎(15/19，73.68%)基因檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；14胎AVSD合并心內(nèi)及心外畸形，其中11胎(11/14，78.57%)基因檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。

3 討論

AVSD是胚胎發(fā)育過(guò)程中心內(nèi)膜墊發(fā)育異常所致先天性心臟畸形，主要特征為房室瓣周?chē)g隔組織部分缺如及房室瓣發(fā)育異常；根據(jù)間隔水平分流情況分為部分型、過(guò)渡型及完全型AVSD[4-5]。胎兒AVSD與染色體非整倍體關(guān)系密切，尤其21三體，約40%的AVSD胎兒合并21三體[6]，而AVSD為21三體患者最常見(jiàn)畸形，提示一旦超聲發(fā)現(xiàn)胎兒AVSD，非常有必要進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)。

本研究采用超聲心動(dòng)圖評(píng)估胎兒AVSD分型及其合并畸形，并分析二代測(cè)序技術(shù)低深度全基因組測(cè)序及全外顯子測(cè)序檢測(cè)AVSD基因的特點(diǎn)，以期為制定圍產(chǎn)期管理策略提供依據(jù)?；町a(chǎn)兒AVSD發(fā)生率0.024%～0.031%[1]，胎兒期AVSD發(fā)生率尚未見(jiàn)報(bào)道。本組胎兒期AVSD發(fā)病率0.71%(150/21 179)，可能與本院為胎兒心臟病轉(zhuǎn)會(huì)診中心有關(guān)；且一經(jīng)診斷胎兒AVSD，大部分孕婦選擇終止妊娠，而AVSD胎兒可能胎死宮內(nèi)，使得本組胎兒期AVSD發(fā)病率明顯高于活產(chǎn)兒。本組超聲心動(dòng)圖明確診斷胎兒AVSD后，均提示孕婦接受母胎醫(yī)學(xué)會(huì)診及咨詢；基于對(duì)預(yù)后及可能發(fā)生的遺傳學(xué)異常的了解，大部分孕婦及家庭選擇終止妊娠。

本組47胎AVSD接受遺傳學(xué)檢測(cè)，超聲診斷時(shí)孕周為16～37周，平均(25.0±5.9)周，其中80%為22周超聲排查畸形發(fā)現(xiàn)異常而經(jīng)胎兒超聲心動(dòng)圖專(zhuān)項(xiàng)檢查檢出。超聲可于妊娠早期發(fā)現(xiàn)AVSD，常在彩色多普勒檢查基礎(chǔ)上聯(lián)合其他危險(xiǎn)因素，如頸項(xiàng)透明層增加、三尖瓣反流、異常靜脈導(dǎo)管血流頻譜及母體血清學(xué)檢測(cè)異常等進(jìn)行提示性診斷，再以有創(chuàng)檢查如羊水穿刺等進(jìn)行染色體非整倍體檢測(cè)[2,7]。對(duì)妊娠早期檢查未見(jiàn)異常的大部分胎兒AVSD，超聲診斷時(shí)間為孕18～24周，即在中孕期排畸檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)異常后經(jīng)胎兒心臟專(zhuān)項(xiàng)檢查診斷。

隨著技術(shù)的發(fā)展，目前胎兒超聲心動(dòng)圖對(duì)18～24周胎兒AVSD已不易漏診，但需注意合并心內(nèi)外畸形。AVSD胎兒易合并心內(nèi)畸形，王琰等[8]報(bào)道其發(fā)生率為67.6%，以錐干系統(tǒng)畸形發(fā)生率最高；繆偉等[9]發(fā)現(xiàn)胎兒AVSD發(fā)生大血管畸形的概率53.6%，本研究結(jié)果與之相近，提示產(chǎn)前診斷AVSD時(shí)應(yīng)警惕其他心內(nèi)畸形，尤其錐干系統(tǒng)畸形。完全型AVSD發(fā)生心外畸形的概率約57.4%[8]，主要包括胎兒水腫、頸部淋巴管囊腫、胎兒鼻骨發(fā)育不良、內(nèi)臟反位、十二指腸閉鎖或狹窄等[8,10]。本研究中40.43%的AVSD胎兒合并心外畸形，其中89.47%為內(nèi)臟異位，其他系統(tǒng)畸形發(fā)生率低，推測(cè)與本組進(jìn)行胎兒心臟專(zhuān)項(xiàng)檢查時(shí)孕周為(25.0±5.9)周有關(guān)：妊娠早期檢出的AVSD胎兒可能存在多系統(tǒng)畸形，后經(jīng)遺傳學(xué)檢測(cè)明確診斷；而不存在多系統(tǒng)畸形的AVSD胎兒多于孕22～24周經(jīng)心臟專(zhuān)項(xiàng)檢查發(fā)現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)異常而獲得明確診斷，此時(shí)其他系統(tǒng)畸形往往不明顯，而心臟異常相關(guān)的內(nèi)臟異位發(fā)生率高。

以往胎兒異常遺傳學(xué)檢測(cè)多局限于染色體層面[11]。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，特別是二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，目前對(duì)于AVSD的遺傳學(xué)檢測(cè)趨于精準(zhǔn)深入。既往研究[12]認(rèn)為約1/4唐氏兒合并AVSD，58%的完全型AVSD與21三體相關(guān)，亦常合并其他染色體異常，如18三體，13三體，22q11微缺失，8p21-p23缺失，46XY等，或?yàn)槟骋痪C合征的心臟表現(xiàn)，如Charge綜合征，其致病基因系CHD7，75%合并先天性心臟病，最常見(jiàn)者為法樂(lè)氏四聯(lián)癥和完全型AVSD；Noonan綜合征致病基因系PTPN11，約18.3%合并完全型AVSD；部分型AVSD常與Ellis-van Crevel(EVC)綜合征相關(guān)，其致病基因系EVC/EVC，50～60%存在心臟異常，最常見(jiàn)者為單心房、AVSD及肺靜脈畸形引流[2,7]。

AVSD亦可單發(fā)，即不作為某綜合征的心臟表型，或不合并其他表型，其遺傳學(xué)機(jī)制可能為多因素遺傳或新發(fā)變異，發(fā)生率為1/10 000[13]，已發(fā)現(xiàn)主要致病基因?yàn)锳LK3、BMP4、GATA4、CRELD1、NKX2.5等[14-15]。本研究采用低覆蓋度全基因組測(cè)序及全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)AVSD的遺傳學(xué)異常不僅包括非整倍體、染色體大片段重復(fù)，同時(shí)存在單基因突變，包括CCDC14、EVC、PQBP1、ZFPM2、ARMC4、DNAH11，進(jìn)一步證實(shí)AVSD基因改變可能發(fā)生在不同基因水平，同時(shí)受多因素影響；AVSD合并心內(nèi)畸形胎兒基因檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率40.74%，合并心外畸形胎兒基因檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率高達(dá)73.68%，高度提示AVSD合并心外畸形胎兒更多存在基因異常。

綜上所述，胎兒AVSD、尤其完全型AVSD易合并心內(nèi)外畸形。AVSD胎兒基因異常發(fā)生率較高，合并心外畸形時(shí)更易合并染色體異常，產(chǎn)前超聲診斷AVSD后應(yīng)行遺傳學(xué)檢測(cè)。二代測(cè)序技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)不同水平基因異常。