蛋白質(zhì)組學在糖尿病及其并發(fā)癥中的應用

陶穎君，吳 潔，劉 暢

（中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院，南京211198）

1 蛋白質(zhì)組學及其研究方法

蛋白質(zhì)組學本質(zhì)是在大規(guī)模水平上對蛋白質(zhì)進行研究，包括蛋白質(zhì)表達、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間相互作用等［1］。通過全面篩選復雜的蛋白質(zhì)，測量多種蛋白質(zhì)變化并運用大量生物信息學技術(shù)等，提供蛋白質(zhì)表達改變的定性和定量證據(jù)［2］，最終整體而全面地認識蛋白質(zhì)水平上疾病的發(fā)生以及細胞的變化等過程。

目前研究蛋白質(zhì)組學主要的方法包括雙向凝膠電泳（2-DE）、高效液相色譜（HPLC）、飛行時間質(zhì)譜（TOF-MS）、同位素親和標簽（SID-MRM）、半定量多反應監(jiān)測（SQ-MRM）和生物信息學技術(shù)等，其中最常用的是雙向凝膠電泳和高效液相色譜法。雙向凝膠電泳是一種多功能的基于凝膠的技術(shù)，可以對蛋白質(zhì)進行定性和定量分析。通過凝膠圖像分析顯示不同樣品或條件之間差異表達的斑點，結(jié)合質(zhì)譜則可以進一步識別所選斑點中存在的蛋白質(zhì)從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的鑒定［3］（如圖1）。高效液相色譜以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)實現(xiàn)對樣品的分析，在典型條件下與質(zhì)譜儀在線耦合，從而對分析柱中洗脫的肽或蛋白質(zhì)直接進行定性或定量分析［4］。隨著更多更好性能的質(zhì)譜儀逐漸普及，并行反應監(jiān)測（PRM）和質(zhì)譜連續(xù)窗口分段式掃描技術(shù)（SWATH）可以提供關(guān)于不同條件下更多蛋白質(zhì)組變化的定性和定量數(shù)據(jù)，監(jiān)測各種條件下個體蛋白質(zhì)相對或絕對水平的變化，從而為生物標志物研究提供更多有價值的信息［5］，并且為蛋白質(zhì)組學的研究提供了便利。

圖1 蛋白質(zhì)組學雙向凝膠電泳（2-DE）檢測示意圖

2 糖尿病

1 型糖尿?。═1D）是一種慢性自身免疫性疾病，是由胰島β 細胞，免疫系統(tǒng)和遺傳易感個體的外部環(huán)境之間復雜的相互作用引起的［6-7］，占我國糖尿病10%左右。2 型糖尿?。═2D）是以胰島功能受損、胰島素抵抗為主要病因而導致的胰島素相對缺乏，受后天生活習慣影響很大，線粒體呼吸活動受損會導致T2D 胰島素抵抗的發(fā)展［8］。我國T2D 占糖尿病的90%左右。糖尿病可導致嚴重的健康問題，尤其是心血管和腎臟并發(fā)癥［9］，是糖尿病患者死亡更主要的原因。由于并發(fā)癥的致死性威脅，早期診斷顯得尤為重要，其有助于控制患者的病情發(fā)展甚至免于手術(shù)治療，對于改善患者預后具有重要意義。而蛋白質(zhì)組學的發(fā)展也為糖尿病早期診斷提供了新的研究方向及可能。

3 蛋白質(zhì)組學與糖尿病及其并發(fā)癥

3.1 蛋白質(zhì)組學在糖尿病診斷與致病機制研究中的應用

目前，在臨床癥狀發(fā)作前用于預測是否有患T1D 風險的最佳方法是測量胰島細胞抗原的自身抗體［10］。這些自身抗原包括谷氨酸脫羧酶（GAD）、蛋白酪氨酸磷酸酶（IA-2）、胰島素以及鋅轉(zhuǎn)運蛋白ZnT8等。盡管多年來自身抗體檢測的性能已大大提高，但并非所有胰島自身抗體陽性受試者都進展至T1D，而且T1D中胰島自身抗體的致病作用仍然難以捉摸［11］，所以無法有效預測T1D的發(fā)生，但是近年來隨著蛋白質(zhì)組學的飛速發(fā)展，對于T1D 的診斷也有了新的進展。Soggiu 等［12］采用高分辨率雙向凝膠電泳分離T1D 患者和健康受試者的尿蛋白，并通過LC-MS/MS 進行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的尿蛋白之間存在差異，其中Tamm-Horsfall尿糖蛋白、載脂蛋白AI、載脂蛋白E、α2-硫醇蛋白酶抑制劑和人補體調(diào)節(jié)蛋白CD59等5種蛋白質(zhì)被下調(diào)，而α-1-微球蛋白、鋅-α2糖蛋白、α-1B 糖蛋白和視黃醇結(jié)合蛋白4等4種蛋白質(zhì)被上調(diào)。

Huth 等［13］運用蛋白質(zhì)組學對與T2D 預測及早期診斷相關(guān)的蛋白質(zhì)進行了鑒定。團隊選擇了892 名年齡在42～81 歲之間的受試者，其中包括123 位T2D 患者和255 位WHO 定義的糖尿病前期患者。得出了甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸肽酶（MASP）水平與T2D 和前驅(qū)糖尿病呈正相關(guān)。脂聯(lián)素與T2D 發(fā)病呈負相關(guān)。 MASP、脂聯(lián)素、載脂蛋白A-IV、載脂蛋白C-II和C反應蛋白等與預后相關(guān)。這些研究在蛋白質(zhì)水平上給糖尿病的預測方法提供了一個新的方向。

近年來的研究表明，T1D的發(fā)生與人類腸道病毒尤其是柯薩奇B 組病毒（group B Coxsackie viruses，CVB）的感染關(guān)系密切。Lietzén 等［14］利用基于質(zhì)譜的蛋白組學研究了CVB 持續(xù)感染人胰腺細胞后對細胞內(nèi)蛋白表達和分泌的影響，發(fā)現(xiàn)會導致一系列廣泛的變化，包括線粒體網(wǎng)絡形態(tài)、能量代謝、分泌途徑調(diào)節(jié)以及抗病毒免疫反應蛋白的表達。該研究結(jié)果為T1D 的病毒致病機制提供了信息和新的研究思路。

3.2 蛋白質(zhì)組學在糖尿病并發(fā)癥診斷中的應用

3.2.1 糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR） 糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是由糖尿病引起的常見微血管并發(fā)癥，這種病癥是血管起源的，其特征是視網(wǎng)膜缺血以及血管通透性增加，是成人T1D 患者視力損害和喪失的主要原因，它在一定程度上最終影響超過90%的糖尿病患者［15-16］。DR 可以在沒有任何嚴重癥狀的情況下發(fā)展，引起視力減退，目前主要治療方法是視網(wǎng)膜光凝術(shù)和玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)［17］，若能及早發(fā)現(xiàn)，則可通過控制系統(tǒng)性危險因素，如高血糖、高血壓和血脂異常等［18］改善臨床癥狀避免手術(shù)。因此DR 的早期發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要，亟需盡快改進DR 的診斷篩查方法。Jin 等［18］進行了一項全面的蛋白質(zhì)組學研究，以確定DR 的生物標志物。其通過使用SQ-MRM 和SID-MRM 分析糖尿病無視網(wǎng)膜病變、輕度和中度非增殖性視網(wǎng)膜病變的患者血漿，得出了4 種蛋白分子：載脂蛋白APO4、C7、CLU 和ITIH2，可作為早期DR 的新型生物標志物，但是該研究需使用更大的蛋白質(zhì)組進行進一步驗證。除此之外，由于淚液可非侵入性收集且含有相對高的蛋白質(zhì)濃度，故其可成為發(fā)現(xiàn)生物標志物的良好來源，有助于早期診斷，因此淚液蛋白質(zhì)組學可以作為一種潛在的新型人群篩查工具［19］。Cs?sz 等［5］在單一系統(tǒng)中使用微動脈瘤檢測器結(jié)合淚液蛋白質(zhì)組學提高了糖尿病視網(wǎng)膜病變篩查方法的敏感性和特異性。運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)檢查淚液，已經(jīng)鑒定出多種蛋白質(zhì)作為糖尿病視網(wǎng)膜病變不同階段的可能生物標志物，而這些生物標志物或許能夠改進已有的DR檢測篩查方法。

3.2.2 糖尿病腎病（DN） 糖尿病腎?。―N）是由于糖尿病影響體內(nèi)葡萄糖平衡而引起的嚴重并發(fā)癥［20］。它已成為發(fā)達國家慢性腎病最常見的原因［21］。在DN 領(lǐng)域的臨床實踐和研究中，尿微量白蛋白（MAU）的概念至關(guān)重要。然而，近年來僅僅基于MAU診斷DN的方法受到質(zhì)疑。雖然MAU的絕對水平和變化率與DN 的發(fā)生和進展有關(guān)，但其本身缺乏準確預測糖尿病腎病的敏感性或特異性［22-23］。de Boer等［24］在糖尿病控制和并發(fā)癥試驗/糖尿病干預和并發(fā)癥流行病學（DCCT/ EDIC）研究中量化了MAU異常變化后長期腎臟轉(zhuǎn)歸的發(fā)生率和危險因素。DCCT 隨機分配了1 441 名T1D 患者進行強化或常規(guī)糖尿病治療，并在觀察性EDIC研究期間對參與者進行隨訪，發(fā)現(xiàn)在持續(xù)性MAU發(fā)展之后，腎臟疾病的進展和消退通常都會發(fā)生。同時，其他縱向觀察性研究發(fā)現(xiàn)在兒童和成人的T1D和T2D患者中也具有相似的現(xiàn)象［25］。因此，這些研究表明MAU 可能不是研究DN 進展的理想標志［26］。而且，雖然腎組織病理學活檢分析能準確診斷糖尿病患者的組織學損傷，但大多數(shù)醫(yī)療中心并不經(jīng)常進行腎活檢分析［27］。所以，除MAU 和腎活檢外，需要尋找更加準確有效的非侵入性生物標志物用于DN的早期診斷。

現(xiàn)已有多種研究蛋白質(zhì)組學的方法用于DN診斷，如2-DE、LC-MS/MS、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜、蛋白質(zhì)微陣列和芯片上的微流體技術(shù)等［28］。Hirao 等［20］通過LC-MS/MS 對無微量白蛋白尿的糖尿病患者和健康受試者的尿蛋白質(zhì)組進行全面分析，采用無標記半定量法和基因本體論分別對健康受試者尿液中的942 種蛋白質(zhì)和糖尿病患者尿液中的645種蛋白質(zhì)進行鑒定分析，通過圖2 嚴格鑒定的蛋白質(zhì)組韋恩圖可以看出，有327種蛋白質(zhì)是健康人群特有的，30種蛋白質(zhì)是糖尿病患者特有的，兩類人群共有615 種蛋白質(zhì)［20］。通過所測蛋白質(zhì)在患者和健康人尿液中的調(diào)節(jié)水平來闡明變化途徑，希望可以發(fā)現(xiàn)用于DN 早期診斷的生物標志物。DN 相關(guān)蛋白質(zhì)組學方法的研究對DN 病理生理學的理解和疾病相關(guān)生物標志物的鑒定起到了關(guān)鍵作用［29］。

圖2 糖尿病患者（DM）與健康受試者（HV）蛋白差異鑒定韋恩圖

3.2.3 糖尿病心肌病（DC） 心血管疾病包括糖尿病心肌病、心血管自主神經(jīng)病變、高血壓以及冠狀動脈心臟病變等致使超過10%的T1DM 患者在40歲之前死亡［30］。秋田小鼠（Akita Ins2WT/C96Y）是一種類似于人類T1DM 進展的小鼠模型，其在5周時會出現(xiàn)明顯的心臟萎縮，是研究DC 的理想模型。Dewey 等［31］對秋田小鼠DC 的發(fā)生進行了研究，用無標記蛋白質(zhì)組學分析5周左右糖尿病小鼠的心臟以鑒定可能在DC 的病理生理學中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。在早期階段，他們發(fā)現(xiàn)GANC、PLEKHN1、COLIA1、GSTK1、EPHX2 等9 種線粒體蛋白質(zhì)在糖尿病小鼠中存在差異表達，qPCR 結(jié)果表明，這些變化主要是由轉(zhuǎn)錄調(diào)控驅(qū)動的。而在EPHX2基因的研究中發(fā)現(xiàn)，其在第3周和第4周表達沒有差異，在第5 周和第12 周分別增加50%和100%。此外，免疫印跡顯示12周齡秋田小鼠的腓腸肌組織中由EPHX2編碼的可溶性環(huán)氧化物水解酶（sEH）增加約100%（P＜0.01）。研究結(jié)果表明，sEH 的增加是DC 發(fā)展的關(guān)鍵因素，因此sEH 可用作DC診斷的潛在靶標。

3.2.4 糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN） 糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，能夠增加潰瘍和下肢截肢的風險，并對生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴重的影響［32］。對DPN 發(fā)病機制的不完全了解在很大程度上阻礙了其有效治療的發(fā)展。一些研究表明，氧化應激特別是由線粒體損傷引起的氧化應激是DPN 的主要誘因［33］。Zhang 等［34］利用蛋白質(zhì)組學分析線粒體蛋白質(zhì)譜的變化來研究DPN的發(fā)病機制及唐洛寧（TLN）對其治療的效果。利用相對和絕對定量標記（iTRAQ）與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用對TLN 治療組大鼠與對照組大鼠進行蛋白質(zhì)定性定量實驗，發(fā)現(xiàn)治療組大鼠與對照組大鼠相比有388 種蛋白差異表達，其中176 種下調(diào)，212 種上調(diào)。對成模大鼠進行分析發(fā)現(xiàn)有11種線粒體蛋白質(zhì)（線粒體復合物Ⅲ細胞色素C 還原酶2、烏頭酸酶和線粒體復合物ⅠNADH-輔酶Q 還原酶5 等）受到影響，而經(jīng)TLN 處理后有4 種蛋白質(zhì)（線粒體復合物Ⅲ細胞色素C 還原酶2、線粒體復合物Ⅲ細胞色素C 還原酶1、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物酶）被逆轉(zhuǎn)，預測這4 種蛋白質(zhì)可能是TLN 的治療靶點。因此，通過蛋白質(zhì)組學方法，可以發(fā)現(xiàn)糖尿病中一系列線粒體蛋白所受到的影響，而這些線粒體蛋白的變化可以幫助解釋疾病的發(fā)病機制并確定潛在的治療靶點。

3.2.5 妊娠期糖尿?。℅DM） 妊娠期糖尿?。℅DM）是指妊娠期出現(xiàn)的血糖異常，作為產(chǎn)科常見孕期合并癥之一，其對于母嬰均有嚴重的不利影響［13］。臨床報道顯示GDM 產(chǎn)婦母嬰并發(fā)癥發(fā)病率及病死率明顯高于健康產(chǎn)婦，圍產(chǎn)期病死率極高［35］。其可以誘使胎兒發(fā)育紊亂，并使孕婦發(fā)生早產(chǎn)、感染、先兆子癇，未來發(fā)生糖尿病的可能性提高。故需要開發(fā)有效的妊娠篩查工具做好臨床GDM 篩查，識別有發(fā)展GDM 風險的孕婦，做到早診斷早治療［36］，這對于改善母嬰預后具有重要作用。Kim等［36］隨機選擇12名在24～28孕周被診斷為GDM 的孕婦血液作為病例，然后選取相同數(shù)量的16～20 孕周健康孕婦血液作為對照，運用SELDI-TOF-MS 技術(shù)進行蛋白質(zhì)組學分析，證明患有GDM 的婦女載脂蛋白CⅢ水平相比對照組顯著升高。數(shù)據(jù)表明，妊娠期糖尿病婦女母體內(nèi)在16～20 周時已經(jīng)存在生物標志物，因此，確定蛋白質(zhì)生物標志物進而預測GDM的后期發(fā)展是完全可行的。

4 展 望

蛋白質(zhì)組學為生命科學的許多研究領(lǐng)域開辟了新的視野，成為近年來興起的研究熱點，也為糖尿病的臨床研究提供了強有力的工具，展現(xiàn)出廣闊的應用前景。相信在未來幾年中，隨著精準醫(yī)療的加入，可以使糖尿病的控制更加有效，從而有希望預防其并發(fā)癥和改善糖尿病患者的生活質(zhì)量［37］。雖然蛋白質(zhì)組學用于糖尿病研究剛起步，但在β 細胞、玻璃體、骨骼肌和心肌等方面已取得一定成果，預計將有更多新的生物標志物被發(fā)現(xiàn)，而這些標志物將在血清、血漿和尿液等樣本的臨床試驗中起著關(guān)鍵作用［38］。然而，雖然蛋白質(zhì)組學技術(shù)已經(jīng)被醫(yī)學界廣泛重視，但是仍存在一些問題，如其發(fā)展尚處于初級階段，雖然許多文獻中報告的候選生物標志物彼此緊密相關(guān)，但很少有研究試圖同時評估多種生物標志物以確定這些相關(guān)生物標志物中最有用的部分［39］。但是隨著質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)的持續(xù)改進以及生物信息學技術(shù)的應用，將使基礎(chǔ)技術(shù)更易于使用且更具效益，其在醫(yī)學和藥物開發(fā)等領(lǐng)域的應用也會更加廣泛。相信在不久的將來，大規(guī)?；谫|(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學方法將在糖尿病及其并發(fā)癥等疾病的研究方面發(fā)揮巨大作用。