斷裂內(nèi)含肽C片段在大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中酶解穩(wěn)定性的改良

陳 浩，曹 津，張 靜，朱建偉，陳俊升

（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，細(xì)胞工程及抗體藥物教育部工程研究中心，上海200240）

斷裂型內(nèi)含肽能夠自發(fā)催化蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)，相比連續(xù)型內(nèi)含肽，它具有抑制不可控的提前剪接和剪切的天然優(yōu)勢，常被用于蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)連接、毒素蛋白的生產(chǎn)等領(lǐng)域［1-3］。

NpuDnaE 是一種來源于念珠藻（Nostoc punctiforme，Npu）的斷裂型內(nèi)含肽，具有高效、快速的蛋白質(zhì)反式剪接活性［4-5］，Ramirez 等［6］在NpuDnaE 中引入D118G 突變，獲得了巰基化合物依賴性的C端剪切突變體，Guan 等［7］在此基礎(chǔ)上開發(fā)了快速蛋白純化系統(tǒng)（SIRP），展現(xiàn)出了NpuDnaE 內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)標(biāo)簽純化領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力。但有文獻(xiàn)報(bào)道，NpuC 段融合蛋白在表達(dá)純化過程中會發(fā)生降解［7-8］，本課題組前期工作中也發(fā)現(xiàn)了NpuC融合蛋白的不同程度降解。這一缺陷將影響前體蛋白收率和產(chǎn)物純度，進(jìn)而增加了目的蛋白特別是藥用重組蛋白的生產(chǎn)成本。因此，提升NpuC 段在表達(dá)、純化過程中的穩(wěn)定性，就顯得尤為重要。

研究人員發(fā)現(xiàn)，斷裂內(nèi)含肽NpuDnaE 的N 段（1-102 aa）和C 段（103-137 aa）的識別、結(jié)合、折疊依賴于兩者之間的靜電作用和疏水作用［8-10］：NpuC攜帶堿性氨基酸，整體片段帶有正電，處于無序狀態(tài)；NpuN 由NpuN1（1-50 aa）和NpuN2（51-102 aa）兩個區(qū)域組成，其中NpuN1 主要由疏水性氨基酸組成，處于折疊狀態(tài)，而NpuN2 集中了大部分的酸性氨基酸殘基，帶有負(fù)電，處于無序狀態(tài)。在NpuN和NpuC的重構(gòu)過程中，NpuN2先與NpuC通過靜電作用結(jié)合、部分折疊，隨后與NpuN1 通過疏水作用進(jìn)一步折疊形成活性構(gòu)象。他們在研究中還發(fā)現(xiàn)NpuC 段的無序狀態(tài)，可能是造成其對蛋白酶不穩(wěn)定的原因。因此，推測使NpuC 段在翻譯后形成部分折疊，將可能減少降解的產(chǎn)生。

本研究從NpuN和NpuC重構(gòu)機(jī)制出發(fā)，構(gòu)建N端融合NpuN2 片段的NpuC 延長變體N2C，技術(shù)路線如圖1 所示，以麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）為NpuC 端外顯肽，研究此延長的NpuC 變體在原核表達(dá)系統(tǒng)中對NpuC 片段的酶解穩(wěn)定性的提升作用，并探討延長變體對內(nèi)含肽C端剪切反應(yīng)活性的影響。

1 材 料

1.1 試 劑

Figure 1 Illustration of the“NpuN2 extended NpuC”. The reconstitution of Npu DnaE follows the“Capture and Collapse”mechanism.NpuC is highly basic,and is disordered,which makes it sensitive to proteolytic degradation (A); NpuN is comprised of two different lobes,NpuN1 (residues 1-50) is partially folded while NpuN2 (residues 51-102) is acidic and disordered (B). NpuC preferentially binds to NpuN2 through the electrostatic interaction to form a compacted intermediate[8]. When N-terminally fused with NpuN2(C),NpuC would readily to form the compacted NpuN2-NpuC intermediates, which would confer NpuC with improved resistance to proteolytic degradation(D)

PCR 所用DNA 聚合酶、連接酶和限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒和PCR 清潔試劑盒均購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；ECL發(fā)光顯色液購自蘇州新賽美生物科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和二硫蘇糖醇（DTT）購自美國Sigma 公司；抗MBP 一抗（鼠源）、抗His 一抗（鼠源）、和羊抗鼠二抗均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物合成及DNA 測序服務(wù)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

DNA 凝膠電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)（上海Tanon 科技有限公司）；蛋白凝膠電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；LRH-70F 型生化培養(yǎng)箱（上海天呈儀器制造有限公司）；鎳柱親和色譜填料（通用電氣（中國）醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部）；Dextrin Beads 6FF 填料（常州天地人和生物科技有限公司）。

1.3 菌株和質(zhì)粒

大腸埃希菌DH5α 和大腸埃希菌BL21（DE3）購自蘇州新賽美生物科技有限公司；包含MBP 的質(zhì)粒pET30a/MBP、包含NpuDnaE斷裂內(nèi)含肽的質(zhì)粒pET28a/Npu、包含硫氧還蛋白（Trx）標(biāo)簽的質(zhì)粒pET32a/野生型，均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

2 方 法

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究使用MBP 作為NpuC 端外顯肽，將NpuC段內(nèi)含肽與之融合后在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)質(zhì)粒的名稱、抗性、目的基因片段的理論相對分子質(zhì)量等信息見表1，本實(shí)驗(yàn)中用到的引物信息見表2。

Table 1 Resistance,insert gene length and restriction enzymes of the recombinant plasmids constructed in this study

Table 1 Resistance,insert gene length and restriction enzymes of the recombinant plasmids constructed in this study

本研究中構(gòu)建的質(zhì)粒均以基本的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段，以酶切連接的方法進(jìn)行構(gòu)建。以下以pET30a/N2C-MBP 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為例進(jìn)行說明。

以上游引物NpuN2-F，含有限制性酶切位點(diǎn)NdeI，下游引物NpuC-MBP-R，以pET28a/Npu質(zhì)粒為模板擴(kuò)增N2C 片段。PCR 條件為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，35 個循環(huán)后，72 ℃終延伸5 min。PCR 產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收待用。同樣的PCR 方法以pET30a/MBP 質(zhì)粒為模板，NpuC-MBP-F 和MBP-R為引物擴(kuò)增MBP片段。

通過重疊PCR 連接N2C 片段和MBP 片段，以NpuN2-F 為上游引物，MBP-R 為下游引物，以回收的N2C 片段和MBP 片段DNA 為模版，重疊PCR 擴(kuò)增N2C-MBP 片段，PCR 程序同N2C 片段的擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳分離得到的N2C-MBP 連接片段，用NdeⅠ和KpnⅠ雙酶切后，連入經(jīng)過NdeⅠ和KpnⅠ雙切的pET30a 質(zhì)粒中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)中，挑取單克隆提取質(zhì)粒并送測序。

表1 中所列其他重組表達(dá)質(zhì)粒均以酶切連接方式構(gòu)建，目的基因DNA 片段使用對應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增。

除外源生物物種的直接輸入對受水湖泊生物群落有影響外，引水調(diào)控引起的受水湖泊水環(huán)境條件的變化對湖泊生物群落的結(jié)構(gòu)、組成以及演替也可能會有影響。引水調(diào)控工程以緩解湖泊藍(lán)藻水華災(zāi)害為主要目的之一，對受水湖泊浮游藻類群落特征的影響最為直接，以浮游藻類群落作為引水調(diào)控工程湖泊生態(tài)效應(yīng)的指示生物能快速反映引水的湖泊生態(tài)效應(yīng)[110]。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

2.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將以上所得重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL 21（DE3）中得到相應(yīng)重組蛋白表達(dá)菌株。挑取單克隆菌落分別接種至含有對應(yīng)抗性的LB 培養(yǎng)基中，在37 ℃，220 r/min 搖床培養(yǎng)9 h 后，將獲得的種子菌液按1∶100接種量接種至LB 培養(yǎng)基500 mL 中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)A600達(dá)到0.6 時，加入IPTG 至終濃度1 mmol/L，過夜誘導(dǎo)培養(yǎng)（25 ℃，180 r/min）。重組蛋白的相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等信息如表3所示。

2.2.2 重組蛋白的親和純化 過夜誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)液經(jīng)4 ℃，5 000 r/min 離心15 min，收集菌體，用上樣緩沖液（20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑）將沉淀菌體重懸分散，用高壓均質(zhì)機(jī)加壓至900 bar（1 bar = 0.1 MPa），4 ℃破菌5 min 后，減壓收集破裂菌液。然后轉(zhuǎn)移至離心機(jī)內(nèi)，4 ℃，12 000 r/min 離心30 min，收集上清液并用0. 45 μm 濾膜過濾后，上樣于鎳親和色譜柱，用上樣緩沖液和2 mol/L 咪唑母液配置不同濃度的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。收集純化過程中的流穿及各洗脫濃度下收集的樣品，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測。

對于NpuC 段重組蛋白，先經(jīng)過上述鎳柱親和純化步驟純化，收集200 mmol/L 咪唑洗脫液，用Dextrin Beads 6FF（MBP 標(biāo)簽親和重力柱）純化，使用 洗 脫 液（20 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L 麥芽糖，pH 8.5）洗脫。收集純化過程中的流穿及洗脫樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

2.3 N2C的C端剪切反應(yīng)

2.3.1 Western blot和SDS-PAGE 檢測N2C 的C端剪切反應(yīng) 為研究N2C的C端剪切反應(yīng)活性，本研究進(jìn)行的C 端剪切反應(yīng)如表4 所示，其中反應(yīng)編號1 為陽性對照組。剪切反應(yīng)體系如下：N 段和C 段底物物質(zhì)的量比（以下簡稱：N/C 比例）為5∶1，DTT濃度為1 mmol/L，反應(yīng)溫度為37 ℃。

反應(yīng)體系在不同時刻取樣，并立即加入還原型5×蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮樣5 min 終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果用SDS-PAGE 和Western blot 進(jìn)行檢測，WB 分別使用抗組氨酸抗體（anti-His）和抗麥芽糖結(jié)合蛋白抗體（anti-MBP）作為一抗。

2.3.2 影響N2C的C端剪切反應(yīng)因素 為了進(jìn)一步研究N2C 的剪切反應(yīng)條件耐受性，本研究對影響其反應(yīng)速率和產(chǎn)物生成率的3個因素進(jìn)行考察：對反應(yīng)溫度的考察中，N/C 比例為5∶1，DTT 濃度為1 mmol/L，溫度分別選取4，25，30，37 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；對N/C 比例的考察中，溫度為30 ℃，DTT 濃度為1 mmol/L，N/C 比例分別選取1∶1，3∶1，5∶1，10∶1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；對DTT 濃度的考察中，溫度為30 ℃，N/C比例為5∶1，DTT濃度分別選取0，1，5，10，50 mmol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對以上3個因素考察的C端剪切反應(yīng)底物為N2C-MBP和NpuN。

Table 4 Reactions to study N2C C-terminal cleavage reaction activity(No.2,No.3,No.4)and reaction of wild type Npu DnaE intein(No.1)

內(nèi)含肽C 端剪切反應(yīng)在0，5，10，30，60，120，360，1 440 min 時刻取樣，并用SDS-PAGE 電泳檢測，用Image J 軟件對SDS-PAGE 電泳圖上的產(chǎn)物條帶和底物條帶進(jìn)行灰度掃描，并按照如下公式計(jì)算C 端剪切反應(yīng)產(chǎn)物生成率。產(chǎn)物生成率（%）=（產(chǎn)物條帶灰度值/產(chǎn)物相對分子質(zhì)量）/［（底物條帶灰度值/底物相對分子質(zhì)量+（產(chǎn)物條帶灰度值/產(chǎn)物相對分子質(zhì)量］×100。反應(yīng)結(jié)果制作曲線。

3 結(jié) 果

3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示N2C-MBP 片段（1 407 bp）、Trx-N2C-MBP 片段（1 773 bp）、Trx-NpuC-MBP 片段（1 587 bp）、Trx-MBP 片段（1 461 bp）、NpuN1 片段（222 bp）和NpuN片段（336 bp）均與理論片段大小一致，電泳結(jié)果如圖2。雙酶切連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α 中，抽提質(zhì)粒后送DNA測序，結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Figure 2 Detection of the PCR products amplified from the constructed plasmids by agarose gel electrophoresis(A)N2C-MBP;(B)1-2:Trx-N2C-MBP;(C)1-2:Trx-NpuC-MBP,3:Trx-MBP;(D)NpuN1;(E)NpuN

3.2 NpuC 段重組蛋白在表達(dá)純化過程中的降解情況

NpuC 段重組蛋白經(jīng)兩步純化后，用SDSPAGE 檢測延長前后的降解情況，并對條帶進(jìn)行灰度掃描作圖，結(jié)果如圖3、圖4 所示，純化條帶大小均符合理論相對分子質(zhì)量。Trx-NpuC-MBP在表達(dá)純化過程中，發(fā)生31.4%～51.6%的降解（圖3-A，圖4-B），不含NpuC 的重組蛋白Trx-MBP 不發(fā)生降解（圖3-B），提示降解發(fā)生在NpuC 段上；此外，在表達(dá)過程中，NpuC 降解條帶并不明顯（圖3-A，泳道2），而在裂菌純化后（圖3-A，泳道5～8），出現(xiàn)降解條帶，提示NpuC 的降解發(fā)生在菌體裂解之后，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

3.3 N2C的C端剪切反應(yīng)

3.3.1 Western blot 檢 測N2C 的C 端 剪 切 反 應(yīng)將不同的N 與C 底物混合反應(yīng)，WB 考察C 端斷裂反應(yīng)，結(jié)果如圖5 所示：NpuN1 與N2C-MBP 的反應(yīng)體系，在42 kD 附近出現(xiàn)單一條帶（圖5，泳道1～2），符合預(yù)期產(chǎn)物相對分子質(zhì)量大?。魂栃詫φ战MNpuN 和Trx-NpuC-MBP 反應(yīng)體系，在42 kD 附近出現(xiàn)單一條帶（圖5，泳道3～4），符合預(yù)期產(chǎn)物相對分子質(zhì)量大??；延長變體N2C-MBP 和Trx-N2CMBP 與NpuN 的反應(yīng)體系，在42 kD 附近出現(xiàn)單一條帶（圖5，泳道5～8），符合預(yù)期產(chǎn)物相對分子質(zhì)量大小。即，N2C 與NpuN1 和NpuN 均能夠發(fā)生C端剪切反應(yīng)。

Figure 3 SDS-PAGE analysis of NpuC-Fusion expression and purificationA:Trx-NpuC-MBP;B:Trx-MBP;C:N2C-MBP;D:Trx-N2C-MBP purification,using Ni column and Dextrin Beads 6FF.BI:before induction,AI:after induction,SF:soluble fraction after lysis,IF:insoluble fraction after lysis,FT1:flow through by Ni column,FT2:flow through by Dextrin,W:20 mmol/L imidazole wash,E1:200 mmol/L imidazole elution,E2:elution by Dextrin.←denotes fusion protein,+denotes degradated species

Figure 4 SDS-PAGE and grayscale scanning analysis of NpuC-Fusion after purificationA:SDS-PAGE of NpuC-fusion,Lane 1,3,5,7,9,11 and 13 were protein eluted by 200 mmol/L imidazole,lane 2,4,6,8,10 and 12 were protein purified by Dextrin. ←denotes fusion protein,+denotes degradated species;B:Degradation histogram of NpuC-fusion(±s,n=4)

3.3.2 SDS-PAGE 檢 測N2C 的C 端 剪 切 反 應(yīng)N2C 的C 端剪切反應(yīng)用SDS-PAGE 檢測結(jié)果如圖6所示，Image J 對結(jié)果灰度掃描計(jì)算剪切反應(yīng)時間曲線結(jié)果如圖7 所示。在1 mmol/L DTT 催化，N/C比例為5∶1，37 ℃反應(yīng)條件下：N2C 與NpuN1 的剪切反應(yīng)（圖6-B），24 h 僅有40%產(chǎn)物生成；N2C 與NpuN的剪切反應(yīng)（圖6-C，6-D），10 min產(chǎn)物生成率達(dá)到70%，30 min達(dá)90%以上；陽性對照組NpuC野生型的C端剪切反應(yīng)（圖6-A），5 min產(chǎn)物生成率達(dá)90%以上。即，N2C 和NpuN 反應(yīng)具有和陽性對照組相似的快速剪切的反應(yīng)特點(diǎn)，但N2C 和NpuN1反應(yīng)效率較差，故對影響C端剪切反應(yīng)因素的考察中使用N2C-MBP和NpuN進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.3.3 影響N2C的C端剪切反應(yīng)的因素 對影響內(nèi)含肽剪切反應(yīng)因素的考察結(jié)果如圖8所示。

對不同反應(yīng)溫度進(jìn)行考察，結(jié)果如圖8-A 所示，37 ℃下反應(yīng)最快，10 min 產(chǎn)物生成率達(dá)到70%，1 h 即達(dá)到平衡；而達(dá)到70%的產(chǎn)物生成率，在30 ℃下需30 min、25 ℃下需60 min、4 ℃下則需6 h以上；反應(yīng)24 h后，所有考察溫度下產(chǎn)物生成率均達(dá)到90%以上。

對不同N/C 比例進(jìn)行考察，結(jié)果如圖8-B 所示，N/C 比例為1∶1 時反應(yīng)初始速率較慢；NpuN 段過量條件下，進(jìn)一步增加NpuN 用量反應(yīng)效率沒有明顯差異；24 h 后，所有考察N/C 比例下產(chǎn)物生成率均在90%以上。

對DTT 濃度進(jìn)行考察，結(jié)果如圖8-C 所示，在0～50 mmol/L DTT 濃度下，剪切反應(yīng)10 min 產(chǎn)物生成率均達(dá)到50%；2 h后，產(chǎn)率均達(dá)到90%以上。

Figure 5 Western blot analysis of the C-terminal cleavage activity of N2C. Reactions were carried out at 37 °C with the N-C ratio of 5∶1, in the presence of 1 mmol/L DTT. The compositions of the reactions were indicated above the figure. Reactions between NpuN fragments and N2C fusions were visualized by Western blot, using anti-His antibody(A) or anti-MBP antibody (B) as the primary antibody respectively.‘MBP’is the cleaved product

4 討 論

內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域是一類頗具應(yīng)用價值的工具，斷裂型內(nèi)含肽NpuDnaE 在介導(dǎo)蛋白質(zhì)剪接和C端剪切方面表現(xiàn)出快速和高效的特點(diǎn)，展現(xiàn)出重大的應(yīng)用潛力，譬如介導(dǎo)免疫毒素的生產(chǎn)［11-12］、雙特異性抗體的裝配［13］、重組蛋白的標(biāo)簽純化［14-15］等。但其在應(yīng)用中遇到的NpuC段發(fā)生的降解，使其在生產(chǎn)應(yīng)用中的收率和產(chǎn)物的純度方面受到一定程度的影響。此外，在腫瘤微環(huán)境下一些基質(zhì)金屬蛋白酶也可能對NpuDnaE內(nèi)含肽造成酶解，限制了NpuDnaE在體內(nèi)，特別是腫瘤微環(huán)境當(dāng)中的應(yīng)用［11］。因此，研究如何提高NpuC 段的穩(wěn)定性具有關(guān)鍵意義。

Figure 6 SDS-PAGE analysis of the C-terminal cleavage activity of N2C. Reactions were carried out at 37°C with the N-C ratio of 5∶1,in the presence of 1 mmol/L DTT. Aliquots at specified time points were visualized on SDS-gels. A:reaction between NpuN and Trx-NpuC-MBP;B:reaction between NpuN1 and N2C-MBP;C:reaction between NpuN and Trx-N2C-MBP;D:reaction between NpuN and N2C-MBP.‘Trx-NpuC’and‘Trx-NpuN2-IC’are the cleaved C-intein fragments.‘+’denotes unidentified band

Figure 7 Time course of the cleavage product formation of different reactant combinations. C-terminal cleavage reactions were carried out at 37 °C in the presence of 1 mmol/L DTT, with the N-C ratio of 5∶1.Aliquots were removed from the mixture at specified time points and quenched by adding SDS-PAGE loading buffer and then visualized by SDS-PAGE

本研究基于N/C 重構(gòu)機(jī)制構(gòu)建了N 端融合NpuN2 片段的NpuC 延長變體N2C，探究了其在原核表達(dá)系統(tǒng)中融合表達(dá)、純化過程中的穩(wěn)定性，并探究了N2C 發(fā)生剪切反應(yīng)的可行性。結(jié)果顯示，N2C 在表達(dá)、純化過程中，降解產(chǎn)物占比從31. 4%～51.6%降低到了2.7%～7.2%；且N2C能與全長NpuN 段發(fā)生快速、高效的C 端剪切反應(yīng)。值得注意的是，N2C 與NpuN1 反應(yīng)效率較低（24 h，40%），較低的反應(yīng)效率可能與NpuN 和NpuC 的重構(gòu)機(jī)制有關(guān)：NpuN1 通過疏水作用與NpuN2 和NpuC 的復(fù)合物進(jìn)一步折疊，作用力弱于NpuN2 與NpuC 的靜電作用，因而表現(xiàn)為N2C 與NpuN1 反應(yīng)效率降低；另外，全長NpuN 能夠與N2C 有較高的反應(yīng)效率，可能是由于N2C 中的NpuC 雖然通過靜電相互作用與融合的NpuN2 相互結(jié)合，但由于NpuN2與NpuC的結(jié)合、折疊處于動態(tài)可逆過程，過量的全長NpuN 會與N2C 中的N2 片段競爭結(jié)合NpuC段，形成能反應(yīng)的正確折疊構(gòu)象。

本研究還對影響斷裂內(nèi)含肽C 端剪切反應(yīng)的因素、反應(yīng)溫度、N/C 比例、還原劑DTT 濃度等條件進(jìn)行了考察，N2C 延長變體表現(xiàn)出與NpuC 野生型相似的條件耐受性［6］。對上述各因素的考察，表明N2C延長變體能夠減少NpuC在融合表達(dá)純化過程中的降解，同時具有良好的C 端剪切反應(yīng)活性，為其應(yīng)用在蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。同時，本課題仍有許多方面可以進(jìn)行更為深入的研究，例如：對其他影響斷裂型內(nèi)含肽反應(yīng)效率的因素進(jìn)行考察優(yōu)化，如純化、剪切反應(yīng)中鹽離子濃度、pH等條件；研究N2C 內(nèi)含肽對其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)造成的影響等。

Figure 8 Time course of N2C C-terminal cleavage under different temperatures (A), different ratios between NpuN and N2C (B), and different concentrations of DTT(C)(±s,n=3). Aliquots were taken at different time points and ran on SDS-gels,then the band intensities corresponding to reactants and products were quantified by Image J