拮抗酵母揮發(fā)性單體桂皮醛對(duì)草莓采后灰霉病的防治

郭虹娜，劉 佳，奚裕婷，周 姣，姜 毅，汪江琦，張艷芬，肖紅梅*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

草莓（Fragaria×ananassa）果實(shí)風(fēng)味鮮美、營(yíng)養(yǎng)成分豐富，深受世界各地人們的喜愛(ài)[1]。但由于草莓果實(shí)質(zhì)地柔軟、果皮極薄，在采收和運(yùn)輸過(guò)程中容易遭受機(jī)械損傷和腐敗微生物的侵染，導(dǎo)致草莓果實(shí)采后貯藏期短，因而經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[2]。軟腐病、灰霉病、炭疽病等是導(dǎo)致草莓腐爛變質(zhì)的主要病害，其中由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是最常發(fā)生和最具有破壞性的病害之一[3-5]。盡管化學(xué)藥劑是控制草莓采后病害最高效普遍的方法，但是藥劑殘留對(duì)人類健康和環(huán)境帶來(lái)的危害不容小覷，所以尋找新的安全有效的綠色方法控制草莓采后病害已成為當(dāng)今的研究趨勢(shì)[6-7]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)酵母及其產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds，VOCs）在拮抗果蔬采后病害過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8-10]。由于VOCs不直接與果實(shí)接觸，對(duì)病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用甚至殺滅作用，此外在抑制病原菌過(guò)程中它們還表現(xiàn)出協(xié)同作用，從而逐漸成為關(guān)注熱點(diǎn)[10]。

拮抗菌產(chǎn)生的VOCs被認(rèn)為是控制果蔬采后病害的有效物質(zhì)[11]。研究發(fā)現(xiàn)威克漢遜酵母（Wickerhamomyces anomalus）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）、假絲酵母（Candida intermedia）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）產(chǎn)生的VOCs可以有效地抑制草莓果實(shí)采后腐爛以及灰霉病的發(fā)生[12-15]。這些VOCs包括酯類、醇類、醛類和酮類等，其不僅能夠減少草莓灰霉病的發(fā)生，其揮發(fā)性單體物質(zhì)如異辛醇、正癸烯、桂皮醛、2-壬酮、戊酸、3-甲基-1-丁醇等對(duì)灰霉孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)也有同樣的抑制作用。

桂皮醛作為一種廣譜抑菌物質(zhì)，可以從肉桂、樟樹(shù)等植物中提取，已被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織與世界衛(wèi)生組織以及美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定為安全無(wú)毒物質(zhì)[16]。Suwanamornlert等[17]發(fā)現(xiàn)桂皮醛蒸汽可以抑制桂圓中病原菌的生長(zhǎng)，對(duì)白地霉（Geotrichum candidum）和擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsisspp.）抑制效果明顯。Mattson等[18]研究發(fā)現(xiàn)桂皮醛處理番茄可以有效地殺死沙門(mén)氏菌，但對(duì)品質(zhì)的影響有待進(jìn)一步研究。肉桂精油對(duì)杏中主要的采后腐敗菌褐腐菌（Monilinia fructicola）和灰霉有抑制作用，并且這一作用主要來(lái)自于肉桂精油中的主要成分桂皮醛[19]。Fathi等[20]也發(fā)現(xiàn)桂皮醛對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用，當(dāng)劑量高于400 μL/L時(shí)可以完全抑制灰葡萄孢的生長(zhǎng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)H. uvarum產(chǎn)生的VOCs對(duì)草莓灰霉病有抑制作用[15]，離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)21 種VOCs單體中桂皮醛對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好[21]。為了進(jìn)一步了解H.uvarum產(chǎn)生的VOCs單體對(duì)草莓果實(shí)抗灰霉病的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以桂皮醛為研究對(duì)象，探索其不同處理參數(shù)對(duì)草莓品質(zhì)、相關(guān)生理指標(biāo)和抗性基因的影響，從而為拮抗酵母揮發(fā)性物質(zhì)抑制草莓灰霉病的可能機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為‘ 紅顏’草莓果實(shí)（Fragaria×ananassaDuch.），清晨采摘于江蘇省南京市江寧區(qū)鎖石生態(tài)園，采后2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。挑選色澤統(tǒng)一、大小一致、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害的完整果實(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

病原菌為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），保存于PDA培養(yǎng)基（4 ℃），接種處理前在PDA培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌水將孢子洗脫，經(jīng)8 層紗布過(guò)濾，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)至所需濃度1×106spores/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

桂皮醛（純度98%） 阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┯邢薰尽?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司；TGL20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湘儀儀器有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波海曙賽富實(shí)驗(yàn)儀器廠；XB-K-25血球計(jì)數(shù)板 國(guó)營(yíng)上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠；HVE-50自動(dòng)蒸氣滅菌鍋 日本Hirayama有限公司；HP-2136便攜式色差儀 上海譜熙光電科技有限公司；WYT-4型手持糖量?jī)x 紹興市億納儀器制造有限公司；TMS-PRO食品物性分析儀 美國(guó)FTC公司；102光學(xué)顯微鏡日本尼康公司；恒溫水浴鍋HH-6 常州國(guó)華電器有限公司；QuantStudio? 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）系統(tǒng) 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同劑量桂皮醛對(duì)草莓灰霉病的影響

草莓果實(shí)用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液消毒10 s后無(wú)菌水沖洗兩遍，自然晾干，無(wú)菌打孔器于草莓赤道部位打孔（3 mm×3 mm），晾干后陽(yáng)性對(duì)照組和桂皮醛處理組草莓傷口部位接種50 μL 1×106spores/mLB. cinerea孢子懸浮液，陰性對(duì)照組草莓傷口部位接種50 μL無(wú)菌水。果實(shí)自然晾干后放置于小干燥器（容積約2 L）隔板上，干燥器底部放置濾紙片（4 cm×4 cm）。對(duì)照組（陰性對(duì)照：H2O處理；陽(yáng)性對(duì)照：CK，接種B. cinerea，不做任何處理）中，濾紙片不添加桂皮醛。桂皮醛處理組中，處理I：濾紙片上添加桂皮醛31.25 μL（劑量為15.62 μL/L）；處理II：濾紙片上添加桂皮醛62.5 μL（劑量為31.25 μL/L）；處理III：濾紙片上添加桂皮醛125 μL（劑量為62.5 μL/L）。將干燥器密封后放置于25 ℃、相對(duì)濕度90%～95%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱，每天進(jìn)行外觀觀察，5 d后分別對(duì)草莓病斑直徑、色差、硬度、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定，以篩選出桂皮醛最佳熏蒸劑量。每個(gè)對(duì)照和處理3 個(gè)平行，每平行10 顆草莓；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 桂皮醛不同熏蒸時(shí)間對(duì)草莓灰霉病的影響

草莓果實(shí)處理方法同1.3.1節(jié)，打孔后接種50 μL 1×106spores/mLB. cinerea孢子懸浮液。對(duì)照：濾紙片不添加桂皮醛；處理：濾紙片上添加125 μL桂皮醛，對(duì)應(yīng)劑量為62.5 μL/L。干燥器密封后放入25 ℃、相對(duì)濕度90%～95%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中分別熏蒸1、2 d和3 d。熏蒸結(jié)束后將草莓果實(shí)放入保鮮盒中，繼續(xù)在25 ℃培養(yǎng)箱中貯藏至第5天。每天觀察病斑直徑，并且取健康果肉用液氮冷凍后放入-80 ℃冰箱保存，用于測(cè)定熏蒸過(guò)程中酶活力和基因相對(duì)表達(dá)量等相關(guān)指標(biāo)。每個(gè)對(duì)照和處理做3 個(gè)平行，每平行10 顆草莓，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 病斑直徑測(cè)定

用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量草莓果實(shí)接種部位病斑直徑的大小，大于0.3 cm的即為發(fā)病，單位為cm。

1.3.3.2 品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

色差采用便攜式色差儀測(cè)定[22]，結(jié)果用L*、a*、b*值表示，L*值代表亮度；a*值表示紅綠度，值越大表示偏紅；b*值表示黃藍(lán)度，值越大表示偏黃。硬度采用TMS-PRO食品物性分析儀測(cè)定，設(shè)置參數(shù)為：下壓速率60 mm/s，形變量40%，高度40 mm，兩次壓縮中間的停頓時(shí)間為5 s，觸發(fā)力為4.0 N?？扇苄怨绦挝镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)采用WYT-4型手持糖量?jī)x測(cè)定，并進(jìn)行溫度校準(zhǔn)?？傻味ㄋ豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參考D’aquino等[23]的方法。

1.3.3.3 酶活力的測(cè)定

從5 個(gè)草莓果實(shí)上取樣，1 g果肉組織中加入5 mL提取緩沖液（含1 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮）研磨混勻后，于4 ℃、10 000 r/min低溫離心15 min，取上清液測(cè)定各酶活力。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力測(cè)定：提取液為50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液。SOD活力的測(cè)定參照Wang Luyao等[24]的方法，采用氮藍(lán)四唑光還原法，以每克樣品抑制反應(yīng)的50%為1 個(gè)酶活力單位（U）。

過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活力測(cè)定：提取液為100 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液。CAT活力的測(cè)定參照Wang Lei等[25]的方法，以每克樣品每分鐘240 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.001為1 個(gè)酶活力單位（U）。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力測(cè)定：提取液為200 mmol/L pH 6.8檸檬酸-磷酸緩沖液。PPO活力的測(cè)定參照Cai Zikang等[26]的方法，以每克樣品每秒398 nm波長(zhǎng)處吸光度增加0.001為1 個(gè)酶活力單位（U）。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的測(cè)定：提取液為50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液。APX活力的測(cè)定參照Cai Zikang等[26]的方法，以每克樣品每分鐘290 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.001為1 個(gè)酶活力單位（U）。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活力測(cè)定：提取液為100 mmol/L pH 8.8檸檬酸-磷酸緩沖液。PAL活力測(cè)定參照Wei Yingying等[27]的方法，以每克樣品每分鐘290 nm波長(zhǎng)處吸光度增加0.001為1 個(gè)酶活力單位（U）。

β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力的測(cè)定：提取液為50 mmol/L pH 5.0醋酸鈉緩沖液。測(cè)定方法參照Wang Lei等[25]的方法，以每克樣品每分鐘在540 nm波長(zhǎng)處吸光度增加0.001為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.3.4 基因表達(dá)量的測(cè)定

草莓RNA提取采用改良CTAB法[28]。反轉(zhuǎn)錄采用RR036A試劑盒進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA -80 ℃存放備用?；虮磉_(dá)水平的測(cè)定采用RR420A試劑盒的方法進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL，混勻后用QuantStudioTM6 Flex儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，上機(jī)反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s，然后95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，共40 個(gè)循環(huán)。所用特異性引物序列見(jiàn)表1。將反應(yīng)結(jié)果用閾值周期（CT值）進(jìn)行歸一化處理，用2?ΔΔCT法[29]來(lái)表示目標(biāo)基因相對(duì)于管家基因（18S rRNA）的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 草莓果實(shí)相關(guān)基因特異性引物序列Table 1 Sequences of specific primers used for polymerase chain reaction amplification of defense-related genes in strawberry fruit

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SAS 8.2軟件進(jìn)行Duncan’s多重比較，P＜0.05表示差異顯著。采用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量桂皮醛熏蒸對(duì)草莓灰霉病的影響

2.1.1 不同劑量桂皮醛熏蒸對(duì)草莓灰霉病的抑制作用

圖1 不同劑量桂皮醛熏蒸處理對(duì)草莓外觀（A）及病斑直徑（B）的影響Fig. 1 Effect of trans-cinnamaldehyde on appearance (A) and lesion diameter (B) of strawberry fruit artificially inoculated with B. cinerea

由圖1A可知，不同劑量的桂皮醛處理對(duì)B.cinerea均有抑制作用，劑量越高病斑直徑越小，抑制效果越明顯。從圖1B可以看出，接種無(wú)菌水的草莓（陰性對(duì)照）病斑直徑為0，接種B. cinerea但無(wú)桂皮醛熏蒸處理的草莓（CK組）病斑直徑最大，為1.9 cm，而接種B. cinerea后分別采用15.62、31.25、62.5 μL/L的桂皮醛熏蒸處理5 d的草莓病斑直徑分別只有陽(yáng)性對(duì)照的79%、47%、40%?？梢?jiàn)桂皮醛熏蒸處理能顯著抑制草莓灰霉病的發(fā)展（P＜0.05），其中劑量為62.5 μL/L時(shí)的抑制效果最好。

2.1.2 不同劑量桂皮醛熏蒸對(duì)草莓品質(zhì)指標(biāo)的影響

圖2 不同劑量桂皮醛處理對(duì)草莓品質(zhì)指標(biāo)的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of trans-cinnamaldehyde on quality parameters of strawberry fruit

顏色是影響消費(fèi)者選擇果實(shí)的一個(gè)重要因素。L*值代表亮度，經(jīng)常用來(lái)評(píng)價(jià)草莓貯藏期間的褐度和亮度。從圖2A可知，草莓在25 ℃下放置5 d后，與處理前相比L*值呈下降趨勢(shì)，與CK組相比，桂皮醛熏蒸處理能顯著延緩草莓L*值的下降（P＜0.05），62.5 μL/L桂皮醛處理效果最好，15.62 μL/L和31.25 μL/L處理組之間無(wú)顯著差異。a*值表示紅度，值越大表示顏色越紅，可以反映果實(shí)的成熟度。從圖2B可以看出，草莓貯藏后a*值上升，陽(yáng)性對(duì)照組a*值最大（34.16），62.5 μL/L處理組a*值最?。?9.73），桂皮醛處理能顯著抑制草莓變紅（P＜0.05），但不同劑量處理組間無(wú)差異。b*值代表黃藍(lán)度，正值表示偏黃[21]。如圖2C所示，貯藏后所有草莓b*值都明顯下降，兩個(gè)對(duì)照組下降程度最大，而不同劑量桂皮醛處理的草莓b*值始終高于對(duì)照組，15.62 μL/L處理組b*值變化最小，31.25 μL/L和62.5 μL/L處理組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明桂皮醛劑量越高，對(duì)b*值影響越大。

硬度是草莓一個(gè)重要的品質(zhì)指標(biāo)，影響消費(fèi)者對(duì)草莓的選擇性和接受度。從圖2D可以看出，草莓貯藏后硬度下降，與處理前相比，接種了B. cinerea的各組草莓硬度均顯著下降（P＜0.05）。不同劑量桂皮醛熏蒸處理組硬度均低于CK組，說(shuō)明桂皮醛熏蒸處理在保持草莓硬度方面無(wú)明顯作用。隨著桂皮醛處理劑量的升高，草莓硬度逐漸增加，62.5 μL/L處理組硬度為22.05 N，與CK組無(wú)顯著差異。

各處理組可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)如圖2E所示，在25 ℃放置5 d后草莓可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均下降，其中陽(yáng)性對(duì)照組（CK組）可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于陰性對(duì)照組（H2O處理組）；桂皮醛處理組可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著熏蒸劑量的升高而逐漸增加，并且均高于CK組，62.5 μL/L處理組可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（7.6%），和CK組相比差異顯著（P＜0.05），15.62 μL/L和31.25 μL/L處理組同兩個(gè)對(duì)照組均無(wú)顯著差異。

可滴定酸含量可以影響草莓的口感。由圖2F可知，貯藏5 d后兩個(gè)對(duì)照之間可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同，均為0.42%，高劑量桂皮醛處理可以保持果實(shí)可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，62.5 μL/L處理后的草莓可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.47%，顯著高于兩個(gè)對(duì)照組（P＜0.05）。說(shuō)明適當(dāng)劑量的桂皮醛熏蒸處理可以延緩草莓可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降。

2.2 桂皮醛熏蒸時(shí)間對(duì)草莓灰霉病的影響

2.2.1 桂皮醛熏蒸時(shí)間對(duì)草莓灰霉病的抑制作用

圖3 桂皮醛不同熏蒸時(shí)間處理對(duì)草莓外觀的影響Fig. 3 Effect of trans-cinnamaldehyde fumigation time on appearance of strawberry fruit

圖4 桂皮醛不同熏蒸時(shí)間對(duì)草莓病斑直徑的影響Fig. 4 Effect of trans-cinnamaldehyde fumigation time on lesion diameter of strawberry fruit

由圖3和圖4A可以看出，果實(shí)經(jīng)處理2 d和3 d時(shí)，對(duì)照組和處理組草莓出現(xiàn)了不同程度的病斑，但對(duì)照組病斑直徑都大于處理組（P＜0.05）；桂皮醛熏蒸處理3 d時(shí)對(duì)照組病斑直徑為處理組的3.9 倍。由圖4B可知，當(dāng)各處理組草莓繼續(xù)在25 ℃放置到第5天時(shí)，草莓病斑都有明顯的擴(kuò)大，桂皮醛處理組草莓病斑直徑始終顯著小于對(duì)照組（P＜0.05），熏蒸時(shí)間越長(zhǎng)草莓病斑直徑越小，相對(duì)于熏蒸1 d和2 d，桂皮醛熏蒸處理3 d對(duì)草莓灰霉病的抑制效果最好，此時(shí)對(duì)照組病斑直徑為處理組的1.9 倍。

2.2.2 桂皮醛熏蒸過(guò)程中草莓抗性相關(guān)酶活力的變化

圖5 桂皮醛熏蒸過(guò)程中草莓CAT （A）、SOD （B）、PPO（C）、APX（D）、PAL（E）、GLU（F）活力的變化Fig. 5 Effect of trans-cinnamaldehyde fumigation time on CAT (A),SOD (B), PPO (C), APX (D), PAL (E) and GLU (F) activities in strawberry fruit

CAT、SOD是植物體中重要的清除活性氧的關(guān)鍵酶。由圖5A可知，CAT活力在接種B. cinerea后逐漸升高，對(duì)照組在熏蒸2 d時(shí)CAT活力達(dá)到最大值，第3天有所下降，而桂皮醛熏蒸處理組草莓CAT活力呈一直上升趨勢(shì)，除了熏蒸2 d時(shí)處理組草莓的CAT活力比對(duì)照組低外，其余時(shí)間時(shí)處理組活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），由此可以看出桂皮醛熏蒸處理可以保持CAT較高的活力。

由圖5B可知，草莓SOD活力在接種B.cinerea后有所降低，1 d以后桂皮醛處理的草莓SOD活力逐漸上升，而對(duì)照組草莓SOD活力變化不大，整個(gè)貯藏過(guò)程中處理組草莓的活力始終顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），熏蒸第3天時(shí)處理組SOD活力是對(duì)照組的1.43 倍。

由圖5C可知，PPO活力在熏蒸過(guò)程中呈先下降后上升的趨勢(shì)，處理組和對(duì)照組趨勢(shì)保持一致，但在整個(gè)貯藏過(guò)程中處理組的PPO活力始終比對(duì)照組高，并且在第1天和第2天處理組的活力與對(duì)照組間差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明桂皮醛處理可以延緩前期PPO活力的降低，并快速提高后期的PPO活力。

由圖5D可知，APX活力在熏蒸期間呈先上升后下降趨勢(shì)，熏蒸1 d時(shí)，桂皮醛處理組能快速誘導(dǎo)活力上升并顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），之后對(duì)照組和處理組同在第2天時(shí)達(dá)到最大，第3天開(kāi)始下降。

由圖5E可知，PAL活力在熏蒸期間先上升后下降，第1天時(shí)對(duì)照組和處理組都達(dá)到最大，除了第2天處理組PAL活力低于對(duì)照組，其他時(shí)間處理組均高于對(duì)照組。

由圖5F可知，GLU活力在貯藏期間先上升后下降，對(duì)照組和處理組分別在第1天和第2天達(dá)到最大值，第2天和第3天時(shí)處理組GLU活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分別為對(duì)照組的1.95 倍和1.92 倍，說(shuō)明桂皮醛熏蒸處理可以有效提高GLU活力并且延緩其下降。

2.2.3 桂皮醛不同熏蒸時(shí)間對(duì)草莓抗性相關(guān)基因表達(dá)量的影響

圖6 桂皮醛不同熏蒸時(shí)間對(duì)草莓果實(shí)FaCAT（A）、FaAPX（B）、FaPPO（C）、FaSOD（D）、FaPAL（E）、FaGLU（F）基因表達(dá)量的影響Fig. 6 Effect of trans-cinnamaldehyde fumigation time on expression levels of FaCAT (A), FaAPX (B), FaPPO (C), FaSOD (D), FaPAL (E), and FaGLU (F) in strawberry fruit

如圖6A、B所示，桂皮醛熏蒸處理草莓在前期（熏蒸的前2 d）并不能快速誘導(dǎo)FaCAT和FaAPX基因相對(duì)表達(dá)量的提高，對(duì)照組和處理組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），當(dāng)熏蒸至第3天時(shí)，處理組草莓的FaCAT和FaAPX基因相對(duì)表達(dá)量有明顯的增加，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分別為對(duì)照組的1.50 倍和1.34 倍。FaPPO基因的相對(duì)表達(dá)量在前期有所下降，第3天時(shí)相對(duì)表達(dá)量快速升高，處理組和對(duì)照組趨勢(shì)一致，但桂皮醛熏蒸前期能延緩FaPPO基因相對(duì)表達(dá)量的下降，熏蒸后期時(shí)能顯著誘導(dǎo)FaPPO基因的表達(dá)，熏蒸第3天時(shí)處理組為對(duì)照組的1.42 倍（圖6C）。FaSOD基因相對(duì)表達(dá)量在熏蒸過(guò)程中無(wú)論是對(duì)照組還是處理組都有所下降，對(duì)照組熏蒸過(guò)程中相對(duì)表達(dá)量趨于穩(wěn)定，而處理組草莓熏蒸1 d時(shí)FaSOD基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），第3天時(shí)FaSOD基因相對(duì)表達(dá)量明顯升高，說(shuō)明桂皮醛熏蒸處理在后期能誘導(dǎo)該基因的相對(duì)表達(dá)（圖6D）。如圖6E所示，采用桂皮醛熏蒸處理并不能有效誘導(dǎo)草莓FaPAL基因的高相對(duì)表達(dá)，且在熏蒸過(guò)程中對(duì)照組和處理組草莓FaPAL基因相對(duì)表達(dá)量與第0天相比逐漸降低。草莓經(jīng)過(guò)桂皮醛熏蒸處理并不能誘導(dǎo)草莓前期FaGLU基因相對(duì)表達(dá)量的提高，而第3天時(shí)處理組草莓該基因的相對(duì)表達(dá)量大幅度提高，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），熏蒸第1天和第2天時(shí)處理組FaGLU基因的相對(duì)表達(dá)量均比對(duì)照組低（圖6F）。

3 討 論

前期研究發(fā)現(xiàn)，葡萄汁有孢漢遜酵母揮發(fā)性代謝物能有效抑制草莓灰霉病的發(fā)生，且對(duì)酵母產(chǎn)生的揮發(fā)性單體進(jìn)行的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明桂皮醛對(duì)B.cinerea的抑制效果最好[15,21]，所以本實(shí)驗(yàn)研究桂皮醛對(duì)草莓灰霉病的抑制效果及其機(jī)理。張娜娜等[30]探討了肉桂醛對(duì)番茄采后灰霉病的抑制作用以及對(duì)其品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)離體條件下肉桂醛能有效抑制灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，且在活體中能維持番茄硬度、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)等指標(biāo)，對(duì)番茄灰霉病有很好的抑制效果。本實(shí)驗(yàn)研究了不同劑量的桂皮醛熏蒸處理對(duì)草莓灰霉病的抑制作用以及對(duì)草莓品質(zhì)的影響，從外觀和病斑直徑的結(jié)果來(lái)看，桂皮醛劑量越高，對(duì)灰霉病的抑制效果越好，62.5 μL/L桂皮醛熏蒸處理對(duì)草莓灰霉病的抑制作用最好，這一結(jié)果與Hassani等[19]的研究結(jié)果一致。不同劑量桂皮醛熏蒸處理對(duì)草莓品質(zhì)的影響有差別，草莓經(jīng)過(guò)桂皮醛熏蒸處理后能有效延緩L*值、b*值的下降和a*值的上升，說(shuō)明桂皮醛能延緩草莓果實(shí)顏色變化，維持品質(zhì)；此外，桂皮醛處理能有效保持草莓可溶性固形物和可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但對(duì)維持草莓硬度方面作用不明顯。

盡管桂皮醛抑制灰霉病已有研究，但其抑菌機(jī)理卻少有報(bào)道，于是通過(guò)研究草莓熏蒸過(guò)程中相關(guān)抗性酶活力和抗性基因相對(duì)表達(dá)量的變化來(lái)初步研究其抑制灰霉病的機(jī)理。誘導(dǎo)抗性作為一種可持續(xù)性策略防治果蔬采后病害已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注，在植物體中誘導(dǎo)抗性主要包括兩種方式：系統(tǒng)獲得抗性和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性，這種誘導(dǎo)機(jī)制不能直接誘導(dǎo)植物抗性，而是在植物受到病原菌攻擊時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)更快的抗病防御反應(yīng)，包括活性氧迸發(fā)和病程相關(guān)（pathogenesis related，PR）蛋白的積累等，這一反應(yīng)稱為敏化反應(yīng)[31]。有研究顯示，草莓能夠有效地抵抗病原體首先依賴于受傷組織的生理狀態(tài)（預(yù)防御機(jī)制），其次是通過(guò)植物表面的受體識(shí)別入侵者，然后通過(guò)廣泛的誘導(dǎo)機(jī)制，包括細(xì)胞壁加固、活性氧的生產(chǎn)、植物抗毒素的產(chǎn)生和PR的積累來(lái)抵御病原菌的侵染[32]。Wang Luyao等[24]通過(guò)用葡萄汁有孢漢遜酵母產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體熏蒸草莓發(fā)現(xiàn)，熏蒸處理能有效降低草莓灰霉病發(fā)病率，誘導(dǎo)抗病相關(guān)酶CAT、SOD、APX、PPO、PAL活力的積累，并且增加這些酶相關(guān)基因的表達(dá)。而秦曉杰等[5]研究也發(fā)現(xiàn)水楊酸結(jié)合葡萄有孢漢遜酵母能顯著提升草莓抗氧化酶SOD、CAT、APX等的活力，減少草莓病害發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其一致，與對(duì)照組相比，草莓在桂皮醛熏蒸的過(guò)程中能顯著提高CAT、APX和PPO的活力，延緩SOD活力的下降，在病害發(fā)生時(shí)CAT、SOD和APX活力升高有利于清除植物體內(nèi)過(guò)量的活性氧，減少自由基對(duì)果實(shí)傷害從而增加果實(shí)對(duì)病害的抗性[29]。此外，有研究表明在植物受到微生物侵染的過(guò)程中，PPO將酚類物質(zhì)氧化成醌類，而醌類物質(zhì)可作為抗菌成分參與到抵御病害的過(guò)程中[6]。從基因表達(dá)情況來(lái)看，與對(duì)照相比，桂皮醛處理能誘導(dǎo)草莓果實(shí)中FaCAT、FaPPO和FaAPX基因表達(dá)的提高。PAL是苯丙氨酸代謝途徑中的第一關(guān)鍵酶，在植物抗性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，增加果實(shí)抗病性。GLU作為細(xì)胞水解酶可以分解病原菌細(xì)胞壁或菌絲從而減少病原菌的侵害[33]。一般來(lái)說(shuō)，植物防御系統(tǒng)由細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分、植物化學(xué)物質(zhì)和PR組成，Wang Xiaoran等[34]研究表明伯克霍爾德菌（Burkholderia contaminans）處理能顯著提高草莓PAL等抗性酶活力。與對(duì)照組相比，桂皮醛熏蒸處理能延緩PAL活力的下降，桂皮醛處理的草莓在第1天時(shí)GLU活力低于對(duì)照組，然而在后期GLU活力快速提高，從而提高草莓抗性。FaPAL和FaGLU基因相對(duì)表達(dá)水平與PAL和GLU活力的變化基本一致，F(xiàn)aPAL相對(duì)表達(dá)水平可以反映PAL活力的變化趨勢(shì)，而FaGLU在后期的表達(dá)水平有所提高，可以誘導(dǎo)GLU活力的增加，這一研究結(jié)果與Wang Meiyan等[35]的一致。

4 結(jié) 論

綜上，62.5 μL/L劑量的桂皮醛熏蒸處理3 d對(duì)草莓灰霉病的抑制作用最好，草莓的發(fā)病程度最小，草莓品質(zhì)最佳；與對(duì)照組相比，桂皮醛熏蒸處理過(guò)程中能有效誘導(dǎo)草莓中相關(guān)抗性基因的表達(dá)，提高草莓CAT、PPO、APX和GLU等相關(guān)抗性酶活力，因此推測(cè)桂皮醛通過(guò)誘導(dǎo)抗性來(lái)提高草莓果實(shí)的抗病性，從而抑制灰霉病發(fā)生。